沈芒芒 鄭 燁 顏繼忠 童勝強(qiáng)

（浙江工業(yè)大學(xué)藥學(xué)院，浙江 杭州 310032）

環(huán)糊精作為高效液相色譜 (HPLC)流動(dòng)相手性拆分劑廣泛用于手性藥物的拆分。大多數(shù)環(huán)糊精及其衍生物作為手性流動(dòng)相添加劑的研究表明[1]，環(huán)糊精與溶質(zhì)形成的包結(jié)配合物與固定相的相互作用減弱，保留時(shí)間縮短，分離選擇性提高，可通過包結(jié)常數(shù)解釋配合物在反相液相色譜中的保留行為，這對(duì)拆分手性化合物具有重要的意義。

氟比洛芬 (Flurbiprofen)是一種新型非甾體抗炎鎮(zhèn)痛藥，其化學(xué)名為2-(2-氟-4-聯(lián)苯基)丙酸[2-(2-fluorobiphenyl-4-yl)propanoic acid]，臨床上主要用于治療風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、骨關(guān)節(jié)炎和外傷疼痛等。氟比洛芬分子中α位為手性碳原子，存在1對(duì)光學(xué)對(duì)映異構(gòu)體（其結(jié)構(gòu)見圖1）。研究發(fā)現(xiàn)抗炎成分主要存在于S型異構(gòu)體中，新的研究證明R型異構(gòu)體可防治阿爾茨海默病[2]。因此，對(duì)氟比洛芬對(duì)映體進(jìn)行拆分具有重要意義。已經(jīng)有用熒光光譜法研究β-環(huán)糊精衍生物對(duì)氟比洛芬的包結(jié)作用[3]。Ye Jincui等采用高效液相色譜手性流動(dòng)相法成功拆分了8種2-芳基丙酸類藥物[4]。本文以羥丙基-β-環(huán)糊精為手性流動(dòng)相添加劑，采用C18反相色譜柱,探討了羥丙基-β-環(huán)糊精與氟比洛芬的包結(jié)方式,建立氟比洛芬對(duì)映體的高效液相色譜拆分法,同時(shí)考察了羥丙基-β-環(huán)糊精的濃度、流動(dòng)相pH、有機(jī)調(diào)節(jié)劑和柱溫等因素對(duì)手性拆分的影響。

Fig.1 The structure of Flurbiprofen(圖1 氟比洛芬結(jié)構(gòu)式)

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Water1525系列高效液相色譜儀，配Water1525雙泵，Water2487二極管陣列檢測(cè)器，Water717plus自動(dòng)進(jìn)樣器，Water Breeze色譜工作站；Mettler-Toledo酸度計(jì)。

氟比洛芬對(duì)映體購于北京百靈威化學(xué)技術(shù)有限公司，含量大于99%；羥丙基-β-環(huán)糊精(HP-β-CD)購于山東新大精細(xì)化工有限公司；甲醇為色譜純，其余試劑均為分析純，水為二次蒸餾水。

1.2 色譜條件

色譜柱YMC-Pack ODS-A C18(150 mm×4.6 mm,5 μm);流動(dòng)相為pH=3.5的0.5%乙酸三乙胺緩沖溶液 （含25 mmol/L羥丙基-β-環(huán)糊精）:甲醇=80:20(V/V)；流速為1.0 ml/min；柱溫為37℃；檢測(cè)波長為247 nm；進(jìn)樣量為5 μL。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

精密稱取12.5 mg的氟比洛芬對(duì)映體于25 mL容量瓶中，用甲醇溶解稀釋至刻度線，制成0.5 mg/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液，于4℃冰箱中冷藏保存。臨用時(shí)取上述標(biāo)準(zhǔn)溶液用0.45 μm微孔濾膜過濾，即可在色譜條件下進(jìn)行拆分。

2 結(jié)果與討論

2.1 保留機(jī)制

Armstrong等[5]報(bào)道了在液相色譜中，以環(huán)糊精衍生物作為手性流動(dòng)相添加劑時(shí)，環(huán)糊精衍生物與對(duì)映體可能存在1:1或1:2的包結(jié)關(guān)系，當(dāng)被拆分的溶質(zhì)與環(huán)糊精只形成包結(jié)比為1:1的配合物而不形成1:2的配合物時(shí)，拆分過程中可能存在以下平衡：

其中F為被分離的自由溶質(zhì)氟比洛芬，A是液相色譜柱固定相的吸附點(diǎn)，CD是羥丙基-β-環(huán)糊精分子，F(xiàn)CD是氟比洛芬與環(huán)糊精形成的1:1包結(jié)物，k為氟比洛芬與色譜柱固定相吸附點(diǎn)的吸附平衡常數(shù)，k1為氟比洛芬與環(huán)糊精形成1:1包結(jié)物的包結(jié)常數(shù)。被分離的溶質(zhì)總量Ftot(mol)為：

由色譜容量因子(k'=(tR-t0)/t0)的定義[6]可知：

其中φ為相比率

通過上述(1)-(4)，可以得出

當(dāng)環(huán)糊精與溶質(zhì)以1:1結(jié)合時(shí)，經(jīng)推導(dǎo)得出容量因子與環(huán)糊精濃度的關(guān)系式如下：

由(6)可得。將1/k'對(duì)環(huán)糊精濃度[CD]作圖，若圖為直線即符合上述式子，則可以說明氟比洛芬與環(huán)糊精形成1:1的包結(jié)物，并可以通過直線的斜率和截距求得相應(yīng)的k1，即為包結(jié)常數(shù)。

2.2 不同色譜條件對(duì)手性分離的影響

2.2.1 HP-β-CD濃度對(duì)手性分離的影響

HP-β-CD作為手性拆分劑，其濃度對(duì)分離產(chǎn)生重要影響，具體見表1。實(shí)驗(yàn)表明，隨著HP-β-CD濃度的增加，容量因子顯著降低，這一變化趨勢(shì)與式(6)一致。根據(jù)表1的數(shù)據(jù)分別以兩對(duì)映體的1/k'對(duì)HP-β-CD濃度作圖(圖2)，得到線性回歸方程分別為:

從圖中看出兩曲線都呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，符合式(6)的假設(shè)，說明氟比洛芬與HP-β-CD形成1:1包結(jié)物，且通過截距和斜率得出包結(jié)物的兩對(duì)映體與HP-β-CD形成過程中的包結(jié)常數(shù)，其中 (+)-氟比洛芬的包結(jié)常數(shù)為1.83 L/mol，(-)-氟比洛芬的包結(jié)常數(shù)為1.67 L/mol。

實(shí)驗(yàn)過程中，在一定HP-β-CD濃度范圍內(nèi)，增加HP-β-CD的濃度，對(duì)映體的保留時(shí)間會(huì)縮短，但濃度過高會(huì)導(dǎo)致柱壓過大，影響色譜柱的使用壽命，綜合考慮各個(gè)因素，本文選用HP-β-CD的濃度為25 mmol/L。

表1 HP-β-CD濃度對(duì)容量因子及分離度RS的影響Table1 The effect of the concentration of HP-β-CD on the capacity factor and resolution of flurbiprofen

Fig2 The reciprocal value for experimental capacity factor plotted against the HP-β-CD concentration(圖2 對(duì)映體容量因子的倒數(shù)值1/k'與手性拆分劑HP-β-CD濃度的線性關(guān)系)

2.2.2 流動(dòng)相pH對(duì)手性分離的影響

在手性拆分中，pH對(duì)拆分效果影響較大。實(shí)驗(yàn)中同時(shí)考察了磷酸緩沖溶液和乙酸三乙胺緩沖溶液，用磷酸緩沖溶液柱壓會(huì)高于乙酸三乙胺緩沖溶液，故本文采用乙酸三乙胺緩沖液進(jìn)行不同pH值的考察。在其他條件相同時(shí)，氟比洛芬對(duì)映體在pH值3.0～4.6之間可以達(dá)到較好的分離，其結(jié)果見表2。這可能是因?yàn)榉嚷宸沂且活愑袡C(jī)酸，pH值較低時(shí)，藥物處于分子狀態(tài)，隨著pH值增加，其電離程度增加，在反相柱上的保留時(shí)間縮短。綜合考慮各個(gè)因素，本文選用pH值為3.5。

表2 流動(dòng)相pH值對(duì)分離度的影響Table2 the effect of pH value of mobile phase on the resolution of flurbiprofen

2.2.3 有機(jī)調(diào)節(jié)劑對(duì)手性分離的影響

用HP-β-CD為流動(dòng)相添加劑分離手性藥物時(shí)，需要加入有機(jī)極性調(diào)節(jié)劑以降低其在固定相中的吸附，增大了對(duì)映體與環(huán)糊精的相互作用差異，從而達(dá)到分離目的。在實(shí)驗(yàn)中嘗試了甲醇、乙腈等作為有機(jī)極性調(diào)節(jié)劑，在相同條件下，僅用乙腈不能分離氟比洛芬，而用甲醇可以達(dá)到較好的分離，且隨著甲醇比例的增大，保留時(shí)間減少，但分離度也減少。同時(shí)在實(shí)驗(yàn)中嘗試了甲醇和乙腈混合作為極性調(diào)節(jié)劑，隨著乙腈濃度的增加，保留時(shí)間增加，分離效果增加不明顯。故本文優(yōu)選采用流動(dòng)相中的純甲醇比例為20%作為有機(jī)調(diào)節(jié)劑。

2.2.4 柱溫對(duì)手性分離的影響

柱溫對(duì)手性分離有一定的影響。在本文研究中發(fā)現(xiàn)，隨著溫度的升高，氟比洛芬對(duì)映體的保留時(shí)間縮短，但是分離度逐漸降低。為了達(dá)到好的分離效果，實(shí)驗(yàn)中采用的柱溫為30℃。

在最佳色譜條件下，分離氟比洛芬對(duì)映體，分離結(jié)果見圖3。

Fig.3 HPLC Chromatogram of Flurbiprofen Enantiomers(圖3 氟比洛芬對(duì)映體拆分的高效液相色譜圖)

3 結(jié)論

采用反相高效液相色譜手性流動(dòng)相添加法建立了氟比洛芬對(duì)映體的手性分析方法，表明HP-β-CD與氟比洛芬對(duì)映體是以1:1的方式包結(jié)方式結(jié)合，同時(shí)考察了羥丙基-β-環(huán)糊精的濃度、流動(dòng)相pH值、有機(jī)調(diào)節(jié)劑、柱溫等對(duì)拆分效果的影響，確定了最優(yōu)的手性分離條件。最終色譜條件為：YMC-Pack ODS-A C18(150 mm ×4.6 mm,5 μm)色譜柱，流動(dòng)相為0.5%乙酸(pH3.5,三乙胺調(diào)節(jié))含25 mmol/L羥丙基-β-環(huán)糊精:甲醇 (80:20,V/V)，流速為 1.0 mL/min,柱溫為30℃，紫外檢測(cè)波長為247 nm。

[1]胡育筑,陳玉英,陳德英.HP-β-環(huán)糊精對(duì)鹽酸舍曲林異構(gòu)體手性選擇包合和色譜保留行為影響的研究[J].2004,34(1):239-245.

[2]邢志華,野津,王金宏,等.HPLC法拆分氟比洛芬.黑龍江醫(yī)藥,2012,25(2):198-200.

[3]苗家兵,周濤,唐課文,等.熒光光譜法研究β-環(huán)糊精衍生物對(duì)氟比洛芬的包結(jié)作用.光譜實(shí)驗(yàn)室,2010,27(4):1532-1536.

[4]Ye J C,Yu W Y,Chen G S,et al.Enantiomeric separation of 2-arylpropionic acid nonsteroidal anti-inflammatory drugs by HPLC with hydroxypropyl-β-cyclodextrin as chiralmobile phase additive [J].Biomed.Chromatogr.,2010,24:799-807.

[5]Armstrong D W,Nome F,Spino L A.Efficient detection and evaluation of cyclodextrin multiple complex formations[J].Am.Chem.Soc.,1986,108(7):1418-1421.

[6]陳立仁.液相色譜手性分離[M].北京:科學(xué)出版社,2006:134.