安靜波，郭 健，宋文東，李秋萍，紀(jì)麗麗，仝紹偉，韓絲銀

（1.廣東海洋大學(xué)食品科技學(xué)院，廣東湛江524088；2.廣東海洋大學(xué)理學(xué)院，廣東湛江524088；3.浙江海洋學(xué)院石化與能源工程學(xué)院，浙江舟山316000；4.東華大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，上海200051）

薯莨（Dioscorea cirrhosa Lour）是薯蕷科薯蕷屬的一種藤本植物，藥用其塊莖[1]。味微苦、澀，性微寒，具有清熱解毒，止血活血，收斂止癢，行氣止痛，活血祛瘀，抗菌等功能[2]。長(zhǎng)期以來(lái)其生長(zhǎng)處于自生自滅的野生狀態(tài)，目前主要用于提取其中的色素作為天然染料[3]，民間將其作為草藥主要用于止血等[4]，對(duì)其藥用有效成分的研究很少，并且有效成分尚不明確，而薯莨中化學(xué)成分的研究也多集中于其色素成分單寧方面，使得薯莨的綜合利用也受到了極大的局限。我國(guó)中藥止血藥應(yīng)用歷史悠久，研究中發(fā)現(xiàn)了大量的止血活性成分幾乎囊括了各類化學(xué)成分，主要有氨基酸類、生物堿類、萜類、甾體、酚類、黃酮類、醌類化合物、苯丙素類、脂類等[5-14]。本文對(duì)薯莨乙醇提取物的止血效果進(jìn)行了研究，并初步鑒定了其中的化學(xué)成分，以期利用薯莨的乙醇提取物生產(chǎn)止血藥物，提高薯莨的利用價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

薯莨塊莖 采自廣東省佛山市順德區(qū)大良；小白鼠 昆明種小鼠，雌雄兼用，體重20 ～25g，由廣東醫(yī)學(xué)院提供。

JM-C203T型分析天平 余姚紀(jì)銘稱重校驗(yàn)設(shè)備有限公司；SAM-1560型粉碎機(jī) 臺(tái)州市黃巖迪勝塑料廠；EV201型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 北京萊伯泰科儀器有限公司；GZX-9070MBE型數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱 上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；DH-1831型血?dú)夥治鰞x 南京南分醫(yī)用實(shí)驗(yàn)儀器有限責(zé)任公司；ZG12020型云南白藥 云南白藥集團(tuán)股份有限公司；乙醇 分析純，廣東光華科技股份有限公司；其他實(shí)驗(yàn)所用試劑 均為分析純。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 薯莨乙醇提取物的制備 以80%的乙醇水溶液為溶劑，料液比為2∶1，于60℃的熱水中水浴浸提2h，放暗處?kù)o置12h，過(guò)濾、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，50℃鼓風(fēng)干燥。

1.2.2 給藥方式 實(shí)驗(yàn)共分四個(gè)劑量組，即空白組給予生理鹽水灌胃、高劑量（0.66g/kg）、低劑量組（0.33g/kg），云南白藥組（0.40g/kg）。每個(gè)劑量組10只小鼠，雌雄分配均勻，每天灌胃1次，連續(xù)給藥10d。

1.2.3 小鼠止血指標(biāo)的測(cè)定

1.2.3.1 小鼠出血時(shí)間的測(cè)定[15]末次給藥40min后，剪斷鼠尾遠(yuǎn)端1/3段，立即用秒表計(jì)時(shí)，用濾紙每隔30s吸一次，至無(wú)血痕為止，此時(shí)的時(shí)間即為出血時(shí)間。1.2.3.2 小鼠凝血時(shí)間的確定[15]末次給藥40min后，用眼科彎鑷迅速摘去一側(cè)眼球即有血液流出，于載玻片上滴1滴血（棄掉第1 ～2滴），血滴直徑約5mm，立即記時(shí)，每隔30s用清潔大頭針自血滴邊緣向里輕輕挑動(dòng)1次，并觀察有無(wú)血絲挑起。從采血開始至挑起血絲止，所歷時(shí)間即為凝血時(shí)間。

1.2.3.3 小鼠血小板數(shù)量的檢測(cè) 在小鼠眼球后靜脈叢取血后，采用摘除眼球法取血放入肝素鈉采血管，用全自動(dòng)血細(xì)胞分析儀檢測(cè)血小板數(shù)量。

1.2.4 薯莨提取物化學(xué)成分的鑒定[16-17]

1.2.4.1 黃酮類顏色反應(yīng) 方法a：（三氯化鋁反應(yīng)）將提取液滴在濾紙上，噴灑1%三氯化鋁的乙醇溶液，干燥后，由黃酮類化合物產(chǎn)生的黃色斑點(diǎn)于紫外燈下顯熒光；方法b：（鉛鹽反應(yīng)）1%醋酸鉛及堿式醋酸鉛水溶液，堿式醋酸鉛反應(yīng)更強(qiáng)，可生成黃-紅色沉淀。

1.2.4.2 蒽醌類顏色反應(yīng) 方法a：（堿液反應(yīng)）取提取液1mL置于試管中，加入10%NaOH，觀察顏色變化。溶液呈現(xiàn)紅色或者紫紅色，加入雙氧水后紅色不褪，調(diào)酸性后，紅色褪去。羥基蒽醌類遇堿顯紅-紫紅色，這是蒽醌類一個(gè)很重要的鑒別反應(yīng)；方法b：（醋酸鎂反應(yīng)）取提取液1mL，加入5%醋酸鎂的醇溶液，反應(yīng)生成橙紅、紫紅、藍(lán)紫色配位化合物，表示有羥基蒽醌。

1.2.4.3 多酚類、單寧的顏色反應(yīng) 方法a：（香草醛-鹽酸反應(yīng)）取提取液點(diǎn)于濾紙片上，干后，噴霧或滴加香草醛-鹽酸試劑，立即呈現(xiàn)紅色斑點(diǎn)，說(shuō)明可能含有酚類或單寧；方法b：（三氯化鐵反應(yīng)）樣品溶液加醋酸酸化后，滴加1%三氯化鐵試劑。呈現(xiàn)藍(lán)、墨綠或藍(lán)紫色，證明可能含有酚類或單寧（鞣質(zhì)）。含有沒(méi)食子酸的單寧呈藍(lán)色，含有兒茶酚的單寧呈綠色。

1.2.4.4 皂甙顏色反應(yīng) 方法a：（泡沫反應(yīng)）取提取液2mL置于試管內(nèi)，激烈振搖3min，如果產(chǎn)生持續(xù)性泡沫，可能含有皂甙。一般來(lái)說(shuō)，典型的皂甙反應(yīng)，產(chǎn)生的泡沫很顯著，在試管內(nèi)能持續(xù)10min以上，加熱或加入乙醇，泡沫都不會(huì)明顯減少；方法b：（醋酐-濃硫酸反應(yīng)）取提取液2mL，將溶劑蒸發(fā)掉，殘?jiān)屑尤?.5mL的冰醋酸溶解，再滴加醋酐-濃硫酸試劑3 ～5滴，如果呈紫紅色，并且溶液上層逐漸變綠，表明含甾體皂甙或三萜皂甙。甾體皂甙顯綠色，三萜皂甙顯紅紫色或藍(lán)色。

1.2.4.5 三萜、甾醇類顏色反應(yīng) 方法a：（醋酐-濃硫酸反應(yīng)）取提取液2mL，將溶劑蒸發(fā)掉，殘?jiān)屑尤?.5mL的冰醋酸溶解，再滴加醋酐-濃硫酸試劑3 ～5滴，如果呈紫紅色，并且溶液上層逐漸變綠，表明含甾體皂甙或三萜皂甙。甾體皂甙顯綠色，三萜皂甙顯紅紫色或藍(lán)色；方法b：（氯仿-濃硫酸反應(yīng)）樣品溶于氯仿，加入濃硫酸后，在氯仿層呈現(xiàn)紅色或藍(lán)色，硫酸層有綠色熒光出現(xiàn)。

1.2.4.6 有機(jī)酸類顏色反應(yīng) 方法a：pH試紙檢查；方法b：（溴酚藍(lán)反應(yīng)）具體分析方法如下：提取液滴于濾紙片上，噴灑0.1%溴酚藍(lán)溶液立即在藍(lán)色的背景上顯現(xiàn)黃色的斑點(diǎn)。若反應(yīng)不明顯，再噴灑氨水，暴露在鹽酸氣體中，背景逐漸由藍(lán)色變黃色，而含有有機(jī)酸（鹽）的斑點(diǎn)仍為藍(lán)色。

1.2.4.7 生物堿類顏色反應(yīng) 方法a：（碘-碘化鉀反應(yīng)）取適量提取液加鹽酸至酸性，加碘-碘化鉀鑒別試劑后，立即有淺棕或暗棕色沉淀出現(xiàn)；方法b：（硅鎢酸反應(yīng)）取適量提取液加鹽酸至酸性，加硅鎢酸鑒別試劑后，立即有淺黃或灰白色沉淀出現(xiàn)。

1.2.4.8 蛋白類顏色反應(yīng) 方法a：（加熱沉淀反應(yīng)）取提取液1mL置于試管中，加熱至沸或加5%鹽酸，如發(fā)生混濁或有沉淀表明含有水溶性蛋白質(zhì)；方法b：（茚三酮反應(yīng)）取檢品的水溶液1mL，加入0.1%茚三酮試液2 ～3滴，混勻后加熱煮沸1 ～3min，觀察顏色由粉色變紫紅色再變藍(lán)色。

2 結(jié)果與分析

2.1 薯莨乙醇提取物對(duì)小鼠出血時(shí)間（BT）的影響

如表1所示，給藥10d后的云南白藥組和薯莨高劑量組的BT較給藥前和對(duì)照組均有極明顯的縮短（p＜0.01），薯莨低劑量組的BT也明顯小于給藥前和對(duì)照組（p＜0.05）；薯莨高劑量組和云南白藥組的BT明顯小于薯莨低劑量組（p＜0.01）。由此可見，薯莨的乙醇提取物具有良好的止血作用。

表1 薯莨提取物對(duì)小鼠出血時(shí)間（BT）的影響（±s）Table 1 Effect of the extract of Dioscorea cirrhosa Lour on bleeding time in mice（±s）

表1 薯莨提取物對(duì)小鼠出血時(shí)間（BT）的影響（±s）Table 1 Effect of the extract of Dioscorea cirrhosa Lour on bleeding time in mice（±s）

注：△與正常組相比較p<0.05，△△與正常組相比較p<0.01；▲與薯莨低劑量組相比較p<0.05，▲▲與薯莨低劑量組相比較p<0.01；＊與給藥前相比較p<0.05，＊＊與給藥前相比較p<0.01；表2、表3同。

組別 BT（s）給藥前 給藥后對(duì)照組 348.39±12.44 347.65±13.94云南白藥組 350.7±11.47 290.71±10.38△△▲▲＊＊低劑量組 349.5±14.83 333.28±9.53△＊高劑量組 349.57±13.05 152.26±11.47△△▲▲＊＊

2.2 薯莨乙醇提取物對(duì)小鼠凝血時(shí)間（CT）的影響

如表2所示，給藥10d后的薯莨高劑量組的CT較給藥前和對(duì)照組均有極明顯的縮短（p＜0.01），云南白藥組和薯莨低劑量組的CT也明顯小于給藥前和對(duì)照組（p＜0.05）；薯莨高劑量組的CT明顯小于薯莨低劑量組（p＜0.01），由此可見薯莨提取物的低劑量組和高劑量組都具有良好的凝血作用。

表2 薯莨提取物對(duì)小鼠凝血時(shí)間（CT）的影響（±s）Table 2 Effect of the extract of Dioscorea cirrhosa Lour on clotting time in mice（±s）

表2 薯莨提取物對(duì)小鼠凝血時(shí)間（CT）的影響（±s）Table 2 Effect of the extract of Dioscorea cirrhosa Lour on clotting time in mice（±s）

組別 CT（s）給藥前 給藥后對(duì)照組 97.42±11.27 96.83±11.57云南白藥組 96.32±12.05 84.43±11.31△＊低劑量組 96.23±10.77 82.44±11.91△＊高劑量組 95.70±9.58 45.05±10.80△△▲▲＊＊

2.3 薯莨乙醇提取物對(duì)小鼠血小板數(shù)量（Plt）的影響

如表3所示，給藥10d后的薯莨高劑量組和云南白藥組的Plt較給藥前和對(duì)照組均有極明顯的提高（p＜0.01），薯莨低劑量組的Plt也明顯小于給藥前和對(duì)照組（p＜0.05）；薯莨高劑量組和云南白藥組的Plt較薯莨低劑量組也有極明顯的提高（p＜0.01）。發(fā)生止血和凝血效應(yīng)的機(jī)制有多種，但大都與血小板的作用有關(guān)系，血小板通過(guò)釋放血管收縮物質(zhì)、血小板粘聚成團(tuán)堵塞損傷的血管和促進(jìn)凝血從而有助于暫時(shí)止血。由表3可以看出，薯莨提取物可以明顯提高小鼠血小板的數(shù)量，從而達(dá)到止血的效果。

表3 薯莨提取物對(duì)小鼠血小板數(shù)量（Plt）的影響（±s）Table 3 Effect of the extract of Dioscorea cirrhosa Lour on platelet count in mice（±s）

表3 薯莨提取物對(duì)小鼠血小板數(shù)量（Plt）的影響（±s）Table 3 Effect of the extract of Dioscorea cirrhosa Lour on platelet count in mice（±s）

組別Plt（109/L）給藥前 給藥后對(duì)照組 250.29±24.01 251.89±27.58云南白藥組 251.18±25.05 564.79±22.12△△▲▲＊＊低劑量組 247.09±25.43 276.58±20.79△＊高劑量組 249.59±26.35 921.57±21.73△△▲▲＊＊

2.4 薯莨乙醇提取物的成分鑒定結(jié)果

我國(guó)中藥止血藥應(yīng)用歷史悠久，目前已發(fā)現(xiàn)的止血活性成分主要有氨基酸類、生物堿類、萜類和甾體、酚類、黃酮類、醌類化合物、苯丙素類、脂類等，本實(shí)驗(yàn)對(duì)薯莨的乙醇提取液的成分鑒別，可以推斷薯莨的乙醇提取液中除了薯莨的主要成分酚類和甙類，還可能含有黃酮、蒽醌、三萜、甾醇、有機(jī)酸等止血成分，從而綜合的提高其止血功能。

3 結(jié)論與討論

目前，國(guó)內(nèi)外關(guān)于薯莨的各方面的研究尚處于空白或萌芽階段，其臨床應(yīng)用受到了極大的局限，這對(duì)于薯莨的綜合利用十分不利。因此，挖掘這一寶貴資源的藥用潛力，深入研究薯莨的化學(xué)成分和藥理活性，發(fā)現(xiàn)其發(fā)揮藥理作用的藥效作用部位及其作用機(jī)制，開發(fā)出療效質(zhì)量穩(wěn)定的新藥，實(shí)現(xiàn)中藥現(xiàn)代化非常必要。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)薯莨乙醇提取物的止血效果進(jìn)行了初步的探究，并對(duì)其起止血作用的化學(xué)成分進(jìn)行了初步的鑒定。結(jié)果證明薯莨的乙醇提取物具有良好的止血和凝血效果，其中主要鞣質(zhì)及甙類是薯莨的主要化學(xué)成分，鞣質(zhì)即植物單寧，又稱植物多酚可使創(chuàng)傷后滲出物中蛋白質(zhì)凝固，形成痂膜，致減少分泌和防止感染，并能使創(chuàng)面的微血管收縮，有局部止血作用，可外用于創(chuàng)傷、灼傷。用極細(xì)粉敷于外傷出血處，能當(dāng)即止血，因而具有快速高效特點(diǎn)，可用于應(yīng)急救治藥物[18]。本實(shí)驗(yàn)證明薯莨的乙醇提取液的止血成分除了鞣質(zhì)及甙類，還有黃酮、蒽醌、三萜、甾醇、有機(jī)酸等止血成分，從而綜合提高其止血功能。血小板的主要功能是凝血和止血，修補(bǔ)破損的血管。當(dāng)人體受傷流血時(shí)，血小板受到損傷部位激活因素刺激出現(xiàn)血小板的聚集，成為血小板凝塊，起到初級(jí)止血作用，血小板和血液中的其他凝血物質(zhì)——鈣離子和凝血酶等，在破損的血管壁上聚集成團(tuán)，形成血栓，堵塞破損的傷口和血管，血小板還能釋放腎上腺素，引起血管收縮，促進(jìn)止血。薯莨的乙醇提取物能有效提高Plt，從而縮短出血時(shí)間和凝血時(shí)間。實(shí)驗(yàn)表明薯莨的乙醇提取物具有良好的止血效果，高劑量組的出血時(shí)間、凝血時(shí)間和血小板數(shù)量與正常對(duì)照組和注射前相比具有極明顯的縮短和增加；低劑量組的出血時(shí)間、凝血時(shí)間和血小板數(shù)量與正常對(duì)照組和注射前相比也具有明顯的縮短和增加。薯莨具有良好的止血的作用，因此薯莨的乙醇提取物可用于止血藥物的制備，一方面可以提高薯莨的利用價(jià)值，對(duì)薯莨資源的合理利用具有一定的意義，另一方面也為新的有效止血藥物提供新的資源。但薯莨提取物是否還能通過(guò)加強(qiáng)血管收縮、間接刺激子宮收縮、提高凝血因子數(shù)量等方面來(lái)促進(jìn)止血和凝血的作用，還有待于進(jìn)一步的研究。

表4 薯莨乙醇提取物的成分鑒定結(jié)果Table 4 The active ingredients of Dioscorea cirrhosa Lour ethanol extract

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