黃 菲，張?jiān)弃Q，李雪梅

（沈陽師范大學(xué) 化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，沈陽 110034）

0 引 言

近年來，隨著基因組和EST計(jì)劃的發(fā)展，電子克?。↖n silico cloning）也隨之發(fā)展起來。它是以生物信息數(shù)據(jù)庫中的EST（expressed sequence tag）、核酸序列和蛋白質(zhì)等數(shù)據(jù)庫為基礎(chǔ)，利用生物軟件對(duì)EST序列進(jìn)行拼接延伸，從而獲得目的基因的部分乃至全長(zhǎng)的cDNA序列的新方法［1－2］。

逆境脅迫可以造成植物活性氧代謝紊亂，致使活性氧積累過度，造成植物機(jī)體損傷，影響植物體正常的生理代謝。因此，植物體內(nèi)便會(huì)產(chǎn)生一系列氧清除劑去除體內(nèi)的氧毒害來減弱或消除氧脅迫對(duì)植物所造成的的損傷。超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）、過氧化氫酶（CAT）和抗壞血酸過氧化物酶（APX）都是植物體內(nèi)常見的氧清除劑。對(duì)于植物而言，APX與SOD，CAT相比在減弱或消除植物體內(nèi)H2O2的毒害方面發(fā)揮著更關(guān)鍵的作用［3］。因此，APX的深入研究對(duì)植物體的生長(zhǎng)發(fā)育和應(yīng)對(duì)逆境脅迫具有較深遠(yuǎn)的意義。

本研究運(yùn)用電子克隆的方法，以水稻種子序列為探針，通過甘蔗EST序列數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì)分析，經(jīng)過多次比對(duì)拼接得到甘蔗APX的cDNA序列，并對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)分析，分析和預(yù)測(cè)其結(jié)構(gòu)與功能，并與其他植物進(jìn)行同源性比較，為甘蔗抗氧脅迫進(jìn)一步研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 電子克隆獲得PX2基因序列

以水稻（Oryza sativa）抗壞血酸過氧化物酶OsAPX2基因（GeneBank登錄號(hào)AB053297）為探針，運(yùn)用NCBI中的Blast工具對(duì)甘蔗的EST數(shù)據(jù)庫進(jìn)行搜索，得到與探針序列同源性較高的一系列甘蔗EST序列，利用DNAMAN軟件進(jìn)行拼接、延伸，以拼接好的contig重疊群為新探針，再次搜索EST數(shù)據(jù)庫，直到?jīng)]有新的EST可供拼接。最后，將得到的序列在NCBI非冗余數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì)，進(jìn)行新基因確認(rèn)。

1.2 生物信息學(xué)分析

利用ORF Finder在線檢索S－APX2contig，預(yù)測(cè)并推導(dǎo)其編碼區(qū)以及編碼氨基酸序列。利用在線工具ProtParam分析甘蔗S－APX2基因及其他植物該基因的氨基酸組成以及理化性質(zhì)，并進(jìn)行對(duì)比。使用軟件ProtScale和GOR4對(duì)該基因氨基酸序列的親水性／疏水性以及二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)，并利用NCBI保守結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫（CDD），分析該編碼蛋白的保守結(jié)構(gòu)域。利用在線工具NetPhos2.0Server、SignalP 4.0Serverh、Wolf psort和TMHMM分別對(duì)該蛋白質(zhì)序列進(jìn)行潛在磷酸化位點(diǎn)、信號(hào)肽預(yù)測(cè)、亞細(xì)胞定位、跨膜螺旋區(qū)的預(yù)測(cè)。通過GeneBank中的Blastp程序?qū)Ω收酳－APX2基因編碼氨基酸的同源性進(jìn)行分析，運(yùn)用DNAMAN對(duì)該基因的氨基酸序列和其它物種進(jìn)行多重比對(duì)并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 甘蔗PX2基因的獲得

以水稻（Oryza sativa）OsAPX2基因（GeneBank登錄號(hào)AB053297）作為查詢探針，在NCBI的甘蔗EST庫中檢索，篩選出7條與該序列同源性較高的EST序列。利用DNAMAN對(duì)其進(jìn)行反復(fù)拼接，并在NCBE的Blast系統(tǒng)中重復(fù)檢索拼接，得到一個(gè)長(zhǎng)為1 110bp的cogtig重疊群，拼接示意圖如圖1。通過 NCBI ORF Finder（http：∥www.ncbi.nlm.nih.gov／gorf／gorf.html）軟件預(yù)測(cè)，該序列完整的開放閱讀框長(zhǎng)為975bp，編碼氨基酸為324個(gè)，符合kozak原則（即起始密碼子ATG附近的核苷酸序列以ANNATGG和GNNATGG利用率高，而沒有起始功能的ATG附近的序列則無此保守性），說明拼接獲得的為一條完整的cDNA序列，命名為S－APX2。具體序列信息如圖2所示。

圖1 甘蔗APX基因PX2cDNA拼接圖

圖2 甘蔗PX2基因的cDNA序列（Iength＝1110bp）及氨基酸序列（Iength＝324aa）

2.2 甘蔗S-APX2基因編碼氨基酸一級(jí)結(jié)構(gòu)及疏水性／親水性預(yù)測(cè)及分析

利用ProtParam在線工具對(duì)甘蔗S－APX2基因的理化性質(zhì)，并同其他植物進(jìn)行比對(duì)（如表1），該基因的氨基酸個(gè)數(shù)為324，分子量27627.6Da，等電點(diǎn)為5.52，負(fù)電荷殘基與正電荷殘基個(gè)數(shù)分別為38、29，蛋白質(zhì)不穩(wěn)定系數(shù)為34.77，該蛋白的理化性質(zhì)與禾本科植物水稻、玉米等的APX相似性較高，由此可見該基因拼接的正確率較高。該類蛋白的不穩(wěn)定系數(shù)小于40，可見，該類蛋白質(zhì)較穩(wěn)定［3］。對(duì)甘蔗S－APX2基因編碼的氨基酸序列的親水性／疏水性（如圖3）預(yù)測(cè)的結(jié)果顯示，S－APX2基因多肽鏈的第357位表現(xiàn)為最高值2.022，疏水性最強(qiáng)；第972位表現(xiàn)為最低值－2.244，親水性最強(qiáng)。該蛋白的GRAVY值為0.791，可見該蛋白質(zhì)具有疏水性，推斷為疏水性蛋白。

表1 不同植物APX基因的理化性質(zhì)分析

2.3 甘蔗S -APX2蛋白磷酸化位點(diǎn)及信號(hào)肽預(yù)測(cè)

運(yùn)用NetPhos2.0Server對(duì)該蛋白質(zhì)序列進(jìn)行潛在磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè)分析。結(jié)果顯示，該蛋白具有5個(gè)絲氨酸磷酸化位點(diǎn)、9個(gè)蘇氨酸磷酸化位點(diǎn)以及1個(gè)酪氨酸磷酸化位點(diǎn)（如圖4）。同時(shí)運(yùn)用SignalP 4.0Server預(yù)測(cè)其蛋白信號(hào)肽，結(jié)果如圖5所示，第23位丙氨酸殘基具有最高的原始剪切位點(diǎn)分值0.139，第7位組氨基酸殘基具有最高的信號(hào)肽分值0.850，谷氨酞胺殘基具有最高的綜合剪切位點(diǎn)分值0.306。由此可以推測(cè)，該基因所編碼的蛋白存在信號(hào)肽，并且為分泌蛋白。

圖3 甘蔗PX2蛋白疏水性／親水性的預(yù)測(cè)結(jié)果

圖4 甘蔗S APX2蛋白的磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè)

2.4 甘蔗S-PAX2蛋白亞細(xì)胞定位及跨膜結(jié)構(gòu)域的預(yù)測(cè)分析

利用Wolf psort在線工具對(duì)S－APX2進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示，該蛋白可能定位于線粒體上，為線粒體蛋白質(zhì)。通過TMHMM工具預(yù)測(cè)S－APX2蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域，結(jié)果顯示：該蛋白無跨膜螺旋區(qū)，為非膜蛋白。

圖5 甘蔗PX2蛋白信號(hào)肽的預(yù)測(cè)分析

2.5 甘蔗S－APX2蛋白保守結(jié)構(gòu)域及二級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)分析

通過CDD對(duì)該基因編碼蛋白的保守結(jié)構(gòu)域分析顯示，經(jīng)蛋白保守域分析發(fā)現(xiàn)，含有heme binding site、Substrate binding site、K＋binding site、ascorbate＿peroxidase結(jié)合位點(diǎn)和保守域，屬于plant＿peroxidase－like Superfamily家族（圖6），與種子序列編碼蛋白保守域相一致。

圖6PX2蛋白保守結(jié)構(gòu)域的預(yù)測(cè)分析

GOR4對(duì)甘蔗S－APX2蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)顯示結(jié)果如圖7和表2，α螺旋的比例為30.74%，延伸鏈為13.92%，無規(guī)則卷曲55.34%，其主要結(jié)構(gòu)元件為無規(guī)則卷曲，并且分散于整個(gè)蛋白質(zhì)中。

圖7 甘蔗PX2蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

表2 PX2蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)分析

表2 PX2蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)分析

二級(jí)結(jié)構(gòu)類型 氨基酸殘基數(shù)／個(gè) 百分比／%α螺旋Alpha helix 95 30.74%延伸鏈Extended strand 43 13.92無規(guī)則卷曲Random coil 171 55.34

2.6 甘蔗S-APX2氨基酸同源性分析及進(jìn)化樹的構(gòu)建

利用GeneBank數(shù)據(jù)庫中的Blastp程序（http：∥www.nchi.nlm.nih.gov／BLAST），對(duì)甘蔗SAPX2蛋白的氨基酸進(jìn)行同源性分析，結(jié)果顯示電子克隆獲得的目的基因S－APX2所編碼的氨基酸序列與禾本科植物的同源性較高，這與甘蔗和這些物種同屬于禾木科植物的傳統(tǒng)分類是一致的，進(jìn)一步證明了該基因電子克隆的準(zhǔn)確性。

利用DNAMAN軟件對(duì)甘蔗S－APX2的氨基酸序列和其它物種APX的氨基酸序列進(jìn)行多重比對(duì)的結(jié)果（圖8），以及通過幾個(gè)物種APX基因的核酸序列所構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖9）的結(jié)果進(jìn)一步證明了該基因cDNA序列電子克隆的正確性，說明了本研究所拼接的目的基因?qū)儆贏PX基因家族成員。

圖8 不同植物中APX蛋白與甘蔗PX2蛋白氨基酸序列同源性對(duì)比

3 討 論

圖9 甘蔗PX2蛋白與其他植物該蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹

基因的電子克隆是隨著基因組計(jì)劃和EST計(jì)劃的發(fā)展而興起的，它主要利用不同物種的同類基因之間存在序列保守性原理［4－5］。電子克隆與傳統(tǒng)的基因克隆方法相比，具有高效快速、成本低廉、針對(duì)性強(qiáng)、技術(shù)要求低等明顯優(yōu)勢(shì)［6－7］。由于受到序列資料豐富度的限制，在植物領(lǐng)域基因克隆仍以常規(guī)的試驗(yàn)方法為主，但是隨著EST數(shù)據(jù)庫的不斷完善，利用生物信息學(xué)方法來進(jìn)行某些植物基因的電子克隆己經(jīng)成為可能［8］。迄今，在水稻、小麥、大豆等作物的功能基因克隆中己有報(bào)道，并且在甘蔗中也己有成功的先例［9－10］。本文對(duì)該基因研究的目的就在于為其今后的實(shí)驗(yàn)室克隆及相關(guān)研究奠定了基礎(chǔ)。

4 結(jié) 論

本文應(yīng)用生物信息學(xué)方法，拼接出甘蔗中的一條APX基因（S－APX2）的cDNA全長(zhǎng)序列，并應(yīng)用分子生物學(xué)相關(guān)軟件，預(yù)測(cè)出此基因編碼蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)中的主要結(jié)構(gòu)元件為α螺旋和無規(guī)則卷曲，其分散于整個(gè)蛋白質(zhì)中，具有15個(gè)磷酸化位點(diǎn)，無跨膜螺旋區(qū)，存在信號(hào)肽，可能為疏水性的分泌蛋白，亞細(xì)胞定位分析顯示該蛋白可能定位于線粒體內(nèi)。此外，所克隆的S－APX2基因具有多個(gè)保守功能域，在序列組成、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)等方面，與玉米、小麥、水稻等禾本科植物進(jìn)行氨基酸同源比對(duì)，其APX基因具有高度同源，推測(cè)其具有類似的功能。以上結(jié)果為該基因的實(shí)驗(yàn)室克隆及其后續(xù)的功能鑒定提供了理論依據(jù)。

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