溫?fù)P敏，楊維群，陳長(zhǎng)明，林文東

(泉州醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校，福建泉州362011)

西施舌(Coelomactra antiquata)福建俗稱“海蚌”，個(gè)體較大，肉質(zhì)細(xì)嫩，營(yíng)養(yǎng)豐富，是久負(fù)盛名的珍品佳肴。從上世紀(jì)60年代開(kāi)始，國(guó)內(nèi)學(xué)者便開(kāi)始對(duì)西施舌的生物學(xué)、人工育苗及人工增養(yǎng)殖進(jìn)行研究。特別是高如承等［1－2］研究西施舌附著變態(tài)誘導(dǎo)技術(shù)的突破，西施舌人工育苗取得突破性進(jìn)展。近年來(lái)，福建、江蘇、廣東、山東等地西施舌人工育苗養(yǎng)殖取得成功，極大地豐富了西施舌的資源量，為西施舌的食用和藥用開(kāi)發(fā)利用提供資源。西施舌除食用外，還具有很高的藥用價(jià)值。中醫(yī)素以西施舌性寒、味咸，具有滋陰潤(rùn)燥，利水消腫，化痰軟堅(jiān)的功效，主治陽(yáng)虛消渴，水腫，崩漏，帶下，失眠，腰酸，尿少，痰飲，痔瘡，淋巴結(jié)腫大，甲狀腺腫大等癥［3］。食管癌是人類常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，我國(guó)食管癌發(fā)病率和病死率均居世界之首［4］。多糖(polysaccharide)是由多個(gè)單糖分子縮合、失水而成，是一類分子結(jié)構(gòu)復(fù)雜且龐大的糖類物質(zhì)，具有免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗病毒、抗菌、抗衰老等作用［5］。本文研究西施舌多糖對(duì)人食管癌細(xì)胞增殖及抗氧化活性的影響，旨在為西施舌藥用價(jià)值開(kāi)發(fā)利用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

西施舌 購(gòu)自福建福州程普頭市場(chǎng);人食管癌細(xì)胞株EC－9706 購(gòu)自天呈科技生物公司;DMSO，RPMI1640培養(yǎng)基，小牛血清 購(gòu)自賽默飛世爾科技公司(北京);胰蛋白酶消化液，細(xì)胞裂解液，MTT細(xì)胞增殖及細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒 購(gòu)自碧云天生物公司;注射用環(huán)磷酰胺(CTX) 購(gòu)自山西普德藥業(yè)公司(國(guó)藥準(zhǔn)字H14023686);超氧化物歧化酶(SOD)、過(guò)氧化氫酶(CAT)、總抗氧化活性(T－AOC)、抑制羥自由基活性和考馬斯亮藍(lán)蛋白含量測(cè)定試劑盒 均購(gòu)自南京建成生物研究所。

SP－752紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) 上海光譜儀器有限公司;KDC－160HR高速冷凍離心機(jī) 科大創(chuàng)新公司中佳分公司;FD－1C－50冷凍干燥機(jī) 北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器公司;KHBST－360型酶標(biāo)儀 上?？迫A科技公司;HF－90型CO2培養(yǎng)箱 北京陽(yáng)光思特生物公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 西施舌多糖(polysaccharides from Coelomactra antiquata，PCA)提取 選擇殼長(zhǎng)7～9cm新鮮西施舌成貝，去殼、洗凈、稱取其肌肉50g，剪成約1cm3小塊，放入1000mL燒杯，再加入300mL的雙蒸水，沸水煮30min。冷卻后用定性濾紙過(guò)濾，取濾液Sevag法除蛋白。加入乙醇使最終乙醇濃度為80%，過(guò)夜沉淀。6000×g離心15min收集多糖，低溫冷凍干燥得到西施舌多糖(PCA)粉末［6］。多糖提取率1.47%，用雙蒸水配置成不同濃度用于實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 西施舌多糖對(duì)人食管癌EC－9706細(xì)胞增殖的影響 采用MTT法［6］測(cè)定西施舌多糖對(duì)人食管癌EC－9706細(xì)胞增殖的抑制作用。人食管癌EC－9706細(xì)胞，用含10%胎牛血清的RPMI－1640培養(yǎng)液，在5%CO2、37℃飽和濕度條件下培養(yǎng)。收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，分于96孔板，調(diào)整細(xì)胞濃度約6000個(gè)細(xì)胞每孔。每孔分別加入含西施舌多糖0(空白對(duì)照組)、5、10、20、40mg·mL－1的含 10% 胎牛血清 RPMI－1640培養(yǎng)液中培養(yǎng)，另設(shè)一組含 4mg·mL－1環(huán)磷酰胺(CTX)作為陽(yáng)性對(duì)照。細(xì)胞分別培養(yǎng)12、24、48h。按MTT試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定細(xì)胞增殖抑制率。

細(xì)胞增殖抑制率(%)=(1－實(shí)驗(yàn)組吸光度/空白對(duì)照組吸光度)×100

1.2.3 西施舌多糖對(duì)人食管癌EC－9706細(xì)胞抗氧化活性的影響 人食管癌EC－9706細(xì)胞，用含10%胎牛血清的RPMI－1640培養(yǎng)液，在5%CO2、37℃飽和濕度條件下培養(yǎng)。收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，分于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，倒置顯微鏡觀察細(xì)胞密度約為60%～70%時(shí)，每孔分別加入含西施舌多糖0(空白對(duì)照組)、5、10、20、40mg·mL－1的含 10%胎牛血清 RPMI－1640培養(yǎng)液中培養(yǎng)。細(xì)胞培養(yǎng)48h后，分別吸取細(xì)胞培養(yǎng)板中含不同濃度西施舌多糖的細(xì)胞培養(yǎng)上清液2mL，6000×g離心5min，取上清液，按試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定抑制羥自由基(·OH)能力和總抗氧化(T－AOC)活性。另外，吸去細(xì)胞培養(yǎng)板中的培養(yǎng)上清液，余下貼壁的食管癌細(xì)胞，每孔加入細(xì)胞裂解液1mL，37℃裂解細(xì)胞 5min，12000 × g離心 5min，取上清液，按試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定SOD、CAT活性。

1.2.4 西施舌多糖對(duì)小鼠原代培養(yǎng)肝細(xì)胞抗氧化活性的影響 普通級(jí)KM小鼠(福建醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供)，斷頭處死，放入75%乙醇浸泡消毒1min后帶入細(xì)胞培養(yǎng)室，再放入75%乙醇浸泡消毒1min。解剖小鼠取肝臟，用pH為7.4的PBS沖洗3次，剪碎成約1mm3小塊，加入固液比1∶5的2.5%胰蛋白酶液消化10min，中間搖勻2～3次。用100目網(wǎng)過(guò)濾，取濾液1000×g離心5min，棄上清液，用含10%胎牛血清的RPMI－1640培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度約1×107mL－1。分別加入含西施舌多糖0(對(duì)照組)、5、10、20、40mg·mL－1的含 10%胎牛血清 RPMI－1640 培養(yǎng)液中培養(yǎng)。細(xì)胞培養(yǎng)48h后，分別吸取細(xì)胞培養(yǎng)板中含不同濃度西施舌多糖的細(xì)胞培養(yǎng)上清液2mL，6000×g離心5min，取上清液，測(cè)定抑制羥自由基(·OH)活性和總抗氧化(T－AOC)活性。另外，吸去細(xì)胞培養(yǎng)板中的培養(yǎng)上清液，余下貼壁的小鼠肝細(xì)胞，每孔加入細(xì)胞裂解液 1mL，37℃裂解細(xì)胞5min，12000 ×g離心5min，取上清液，測(cè)定 SOD、CAT活性。

1.3 數(shù)據(jù)分析

用Excel 2003繪圖及進(jìn)行單因素方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 西施舌多糖對(duì)人食管癌細(xì)胞增殖的抑制作用

西施舌多糖對(duì)人食管癌Ec－9706細(xì)胞體外增殖的影響見(jiàn)圖1，從圖1可以看出細(xì)胞培養(yǎng)12h后，所有實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組之間細(xì)胞增殖抑制率無(wú)顯著差異(p＞0.05)。細(xì)胞培養(yǎng)24h后，PCA3和PCA4與對(duì)照組之間細(xì)胞增殖抑制率存在顯著差異(p＜0.05)。細(xì)胞培養(yǎng)48h后，除PCA1外，所有實(shí)驗(yàn)組中食管癌細(xì)胞的增殖抑制率均大于對(duì)照組，與對(duì)照組比較，其中PCA3對(duì)食管癌細(xì)胞的增殖抑制率存在顯著差異(p＜0.05)，PCA4對(duì)食管癌細(xì)胞的增殖抑制率存在極顯著差異(p＜0.01)。

圖1 西施舌多糖對(duì)人食管癌細(xì)胞增殖抑制率的影響Fig.1 Effect of polysaccharides from Coelomactra antiquata(PCA)on growth inhibition of esophageal carcinoma cells

2.2 西施舌多糖對(duì)食管癌細(xì)胞和小鼠原代培養(yǎng)肝細(xì)胞CAT活性的影響

CAT存在于紅細(xì)胞及某些組織內(nèi)的過(guò)氧化物體中，它的主要作用就是催化H2O2分解為H2O與O2，使得H2O2不至于與O2在鐵螯合物作用下反應(yīng)生成非常有害的·OH，是生物防御體系的關(guān)鍵酶之一［7］。西施舌多糖對(duì)食管癌細(xì)胞和小鼠原代培養(yǎng)肝細(xì)胞CAT活性影響見(jiàn)圖2，從圖2可以看出西施舌多糖能增加食管癌細(xì)胞和小鼠原代培養(yǎng)肝細(xì)胞的CAT活性，且活性隨西施舌多糖濃度增加而增大。與對(duì)照組比較，各實(shí)驗(yàn)組CAT活性均存在極顯著差異(p＜0.01)。此外，在西施舌多糖濃度相同的條件下，小鼠原代培養(yǎng)肝細(xì)胞過(guò)氧化氫酶活性均高于食管癌細(xì)胞，且兩者之間存在極顯著差異(p＜0.01)。

圖2 西施舌多糖對(duì)CAT活性的影響Fig.2 Effect of polysaccharides from Coelomactra antiquata on activities of CAT

2.3 西施舌多糖對(duì)食管癌細(xì)胞和小鼠原代培養(yǎng)肝細(xì)胞SOD活性的影響

西施舌多糖對(duì)食管癌細(xì)胞和小鼠原代培養(yǎng)肝細(xì)胞SOD活性的影響見(jiàn)圖3，從圖3可以看出，不同濃度西施舌多糖均能提高食管癌細(xì)胞和小鼠肝細(xì)胞的SOD活性，且SOD活性隨濃度增大而增加。當(dāng)西施舌多糖為5mg·mL－1時(shí)，食管癌細(xì)胞SOD活性與對(duì)照組之間存在顯著差異(p＜0.05)，而小鼠原代培養(yǎng)肝細(xì)胞與對(duì)照組無(wú)顯著差異(p＞0.05)。當(dāng)西施舌多糖濃度為10mg·mL－1及以上時(shí)，與對(duì)照組比較，食管癌細(xì)胞和小鼠原代培養(yǎng)肝細(xì)胞SOD活性均存在極顯著差異(p＜0.01)。此外，在西施舌多糖濃度相同的條件下，小鼠原代培養(yǎng)肝細(xì)胞的SOD活性均高于食管癌細(xì)胞，且兩者之間存在極顯著差異(p＜0.01)。

圖3 西施舌多糖對(duì)SOD活性的影響Fig.3 Effect of polysaccharides from Coelomactra antiquata on activities of SOD

2.4 西施舌多糖對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)上清液T－AOC活性的影響

西施舌多糖對(duì)食管癌細(xì)胞和小鼠原代培養(yǎng)肝細(xì)胞培養(yǎng)上清液T－AOC的活性均隨濃度增加而增強(qiáng)(圖4)，且T－AOC活性與西施舌多糖濃度呈線性關(guān)系。在相同濃度西施舌多糖條件下，食管癌細(xì)胞培養(yǎng)上清液T－AOC活性均小于小鼠肝細(xì)胞，但兩者之間不存在顯著差異(p＞0.05)。當(dāng)西施舌多糖濃度為5mg·mL－1時(shí)，實(shí)驗(yàn)組T－AOC 活性與對(duì)照組之間均無(wú)顯著差異(p＞0.05)。當(dāng)西施舌多糖濃度為10mg·mL－1及以上時(shí)，與對(duì)照組比較，食管癌細(xì)胞和小鼠原代培養(yǎng)肝細(xì)胞的T－AOC活性均存在極顯著差異(p＜0.01)。

圖4 西施舌多糖對(duì)T－AOC活性的影響Fig.4 Effect of polysaccharides from Coelomactra antiquata on activities of T－AOC

2.5 西施舌多糖對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)上清液抑制羥自由基活性的影響

羥自由基(·OH)是已知活性氧中對(duì)生物體毒性最強(qiáng)的一種自由基，過(guò)多羥自由基能殺死紅細(xì)胞，損傷細(xì)胞膜，降解DNA等［8］。西施舌多糖對(duì)食管癌細(xì)胞和小鼠原代培養(yǎng)肝細(xì)胞的培養(yǎng)上清液抑制羥自由基作用隨濃度增加而增強(qiáng)(圖5)。當(dāng)西施舌多糖濃度為5mg·mL－1時(shí)，實(shí)驗(yàn)組抑制羥自由基活性與對(duì)照組之間均存在顯著差異(p＜0.05)，而其它實(shí)驗(yàn)組抑制羥自由基活性與對(duì)照組之間均存在極顯著差異(p＜0.01)。此外，在西施舌多糖濃度相同的條件下，小鼠肝細(xì)胞培養(yǎng)上清液抑制羥自由基活性均高于食管癌細(xì)胞培養(yǎng)上清液，且兩者之間存在極顯著差異(p＜0.01)。

圖5 西施舌多糖對(duì)抑制羥自由基活性的影響Fig.5 Effect of polysaccharides from Coelomactra antiquata on capability to scavenging hydroxyl radicals

3 討論

海洋貝類含有豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，是新型的創(chuàng)新藥物和功能性食品資源［5］。大量的實(shí)驗(yàn)證實(shí)了貝類多糖的抗腫瘤活性，如鮑魚(yú)中提取的多糖能抑制鼻咽癌的增殖;從河蚌、瑪瑙螺中提取的多糖對(duì)離體肺腺癌細(xì)胞、胃癌細(xì)胞有較強(qiáng)的抑制作用;菲律賓蛤仔多糖可顯著抑制白血病細(xì)胞增殖作用［9－11］。貝類多糖抗腫瘤作用的主要機(jī)制與其免疫調(diào)節(jié)和抗氧化作用有關(guān)［9］。腫瘤細(xì)胞內(nèi)普遍存在與正常細(xì)胞不同的氧化壓力，通常維持較高的氧化狀態(tài)，表現(xiàn)為較高水平的自由基和較低的抗氧化酶活性。雖然有研究發(fā)現(xiàn)，肺癌組織中SOD活性明顯高于癌周邊組織和邊緣正常肺組織［12］。但多數(shù)學(xué)者都發(fā)現(xiàn)惡性腫瘤細(xì)胞總的SOD含量低于相應(yīng)的正常組織。腫瘤細(xì)胞內(nèi)SOD含量降低是一種普遍的現(xiàn)象。Westman等［13］發(fā)現(xiàn)不同年齡、性別的不同組織的腫瘤(乳腺癌、腎癌、惡性黑色素瘤、尤文氏肉瘤 淋巴瘤、脂肪肉瘤等)SOD含量明顯低于相應(yīng)的正常組織。Oberley等［14］研究表明，艾氏腹水瘤的小鼠腫瘤組織的SOD含量顯著低于肝臟。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與以上結(jié)論一致，在西施舌多糖濃度相同的條件下，食管癌細(xì)胞SOD和CAT活性均低于小鼠原代培養(yǎng)肝細(xì)胞。而有關(guān)抗腫瘤活性物質(zhì)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞抗氧化酶類活性的影響有不同的報(bào)道?；艏t梅等［15］研究表明高劑量姜黃素能顯著降低乳腺癌MCF－7細(xì)胞的SOD和CAT活性。徐永偉等［16］也發(fā)現(xiàn)紫杉醇能顯著降低犬乳腺腫瘤細(xì)胞的SOD和CAT活性。其原因認(rèn)為降低抗氧化酶活性，會(huì)降低腫瘤細(xì)胞清除自由基的能力，提高腫瘤細(xì)胞自由基含量達(dá)到抑制腫瘤效果。但張秀娟等［17］發(fā)現(xiàn)，花青素對(duì)S180腫瘤具有顯著抑制效果，卻能提高S180腫瘤的SOD活性。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表明，不同濃度西施舌多糖均能提高人食管癌細(xì)胞SOD和CAT活性，且活性隨濃度增大而增加。其原因可能是提高腫瘤細(xì)胞的SOD活性，可使腫瘤細(xì)胞部分獲得正常細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能，從而達(dá)到治療腫瘤效果［18］。

自由基學(xué)說(shuō)認(rèn)為衰老過(guò)程中的退行性變化是由于細(xì)胞正常代謝過(guò)程中產(chǎn)生自由基的有害作用造成的。抗氧化劑和抗氧化酶是人體本身能不斷產(chǎn)生的防御自由基損害的物質(zhì)。有些抗氧化劑可以達(dá)到防御疾病、延緩衰老的目的［19］。天然抗氧化劑被人體攝入后，有的作為體內(nèi)抗氧化酶類的誘導(dǎo)劑，能提高體內(nèi)相關(guān)抗氧化酶類水平;有些抗氧化物質(zhì)被人體攝入后能直接消除自由基。有研究表明西施舌提取物能提高正常小鼠的T－OAC、SOD和POD活性，降低MDA含量，提高小鼠的抗氧化能力［20］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，西施舌多糖能提高體外培養(yǎng)細(xì)胞抗氧化酶活性和清除羥自由基能力，抑制食管癌細(xì)胞增殖。表明西施舌多糖的抗腫瘤效果可能與清除自由基提高機(jī)體抗氧化活性有關(guān)，但其抗腫瘤機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

西施舌多糖對(duì)人食管癌EC－9706細(xì)胞具有體外增殖抑制的作用，其抑制效果具有明顯的濃度依賴性，并隨時(shí)間延長(zhǎng)抑制作用越明顯。西施舌多糖能提高體外培養(yǎng)細(xì)胞抗氧化酶活性和抑制羥自由基活性。在西施舌多糖濃度相同條件下，小鼠原代培養(yǎng)肝細(xì)胞SOD、CAT活性均高于食管癌細(xì)胞，小鼠原代培養(yǎng)肝細(xì)胞培養(yǎng)上清液總抗氧化和抑制羥自由基活性也高于食管癌細(xì)胞。

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