紀(jì) 可，邱芳萍，杜 林，邢 燕

(長春工業(yè)大學(xué)化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，吉林長春130012)

菊苣為菊科菊苣屬多年生草本植物，我國主要分布于西北、東北各省。菊苣根粉可用做沖劑，有健胃、消食和去脂等藥理功效［1－2］，《中國大藥典》記載菊苣根部含大量有效的活性成分，如類黃酮、苷類等。但對其化學(xué)成分的研究及對其提取物的藥理活性方面的研究未見報(bào)道［3］。由于粉碎后沸水煮時有淡淡的咖啡香，并且有提神醒腦的功效，常被當(dāng)?shù)鼐用癞?dāng)做飲料飲用。但大部分菊苣根莖仍被當(dāng)做廢棄物丟掉，資源嚴(yán)重浪費(fèi)。咖啡因是菊苣根中一種重要的營養(yǎng)成分，目前國內(nèi)外尚未見對菊苣根中咖啡因及其抑菌性關(guān)系的研究報(bào)道。少量的咖啡因可使身心處于興奮狀態(tài)［4］，刺激機(jī)體的中樞神經(jīng)系統(tǒng)，增高機(jī)體血糖水平，集中注意力［5］;可作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)的興奮藥劑，能促進(jìn)胃液分泌和治療偏頭痛等疾?。?］，并有良好的抑菌效果［7］，在機(jī)體的多個系統(tǒng)中發(fā)揮著廣泛的作用，研究和開發(fā)天然咖啡因已成為食品藥品界的研究熱點(diǎn)。所以，從廢棄的菊苣根中提取的天然咖啡因替代合成的咖啡因，添加到咖啡飲品中或制成天然植物型抑菌劑等，具有天然性、安全性和功能性，在食品，藥學(xué)等方面有著巨大的應(yīng)用潛力，市場前景廣闊。本實(shí)驗(yàn)以咖啡因標(biāo)準(zhǔn)品為對照，采用紫外全波長掃描，紅外圖譜，高效液相色譜法對菊苣根中咖啡因進(jìn)行分析檢測，考察了菊苣根咖啡因提取物性質(zhì)及結(jié)構(gòu)與標(biāo)準(zhǔn)品的相關(guān)性，并采用一系列真菌和細(xì)菌，對菊苣根咖啡因提取物的抑菌作用進(jìn)行分析，為更好地應(yīng)用菊苣根中咖啡因提供參考依據(jù)，為菊苣根莖的綜合利用提供更為廣闊的市場前景。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

乙醇、乙酸 國產(chǎn)分析純;甲醇、N－N－二甲基甲酰胺 色譜純;牛肉膏、蛋白胨、瓊脂;菊苣根 吉林省和龍市東勝鄉(xiāng);咖啡因?qū)φ掌?天津一方科技有限公司。

枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、大腸埃希菌(Escherichia coli);青 霉 菌(Penicillium sp)、釀 酒 酵 母(Saccharomyces cerevisiae) 長春工業(yè)大學(xué)化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院生物實(shí)驗(yàn)室提供。

日普利RPL－D2000 COLUMN HBATER高效液相色譜儀 配LC－1000D型紫外－可見光檢測器，山東魯南瑞虹化工儀器有限公司;UV1102紫外分光光度計(jì) 上海棱普儀器儀表有限公司;Specturm One紅外線光譜儀 美國PE儀器公司;YXQ－LS立式壓力蒸汽滅菌器 上海申安機(jī)械廠;MJX－250培養(yǎng)箱 吉林省醫(yī)療器械廠。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 色譜條件 色譜柱:C18色譜柱(250mm×4.5mm，20μL);流動相:甲醇∶水∶乙酸∶N－N－二甲基甲酰 =30∶70∶0.05∶0.25;柱溫:25℃;檢測波長:274nm;流速:1mL/min;進(jìn)樣量:10μL。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)液的配制 精密稱取咖啡因標(biāo)準(zhǔn)品5mg，用甲醇∶水=70∶30的混合溶液溶解并定容于10mL容量瓶中，分別移取 0.5、1.0、1.5、2、2.5mL 的標(biāo)準(zhǔn)液分別定容于10mL容量瓶中，超聲波脫氣10min后再通過0.45μm 水系膜過濾［8］，進(jìn)樣量為 10μL，以咖啡因質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.3 樣品前處理 將原材料洗凈后切成片，烘干后粉碎，過60目篩，用濃度為85%的乙醇按料液比為1∶20的比例在索氏提取器中提取，過濾，以6000r/min轉(zhuǎn)速離心10min后減壓濃縮得提取物浸膏，置于烘箱中烘干備用。

稱取適量烘干后提取物，加200.0g/L的亞鐵氰化鉀溶液2.0mL和200.0g/L的堿式乙酸鉛溶液2.0mL除去菊苣根中的蛋白質(zhì)［9］，過濾，濾液超聲脫氣后備用。配制濃度為4mg/mL的樣液［10］，然后用0.45μm濾膜過濾，作為待測樣液，在色譜條件下，進(jìn)樣3次，求出峰面積平均值，計(jì)算咖啡因含量。

1.2.4 檢測波長的選擇 以蒸餾水為空白，在190～1000nm波長范圍內(nèi)分別對咖啡因標(biāo)準(zhǔn)品和菊苣根咖啡因提取物進(jìn)行紫外全波長掃描［11］，觀察最大吸收波長。

1.2.5 咖啡因的檢識 稱取7.3g碘化鉍鉀，加冰醋酸10mL后用60mL蒸餾水溶解，制成檢識液，向待測樣液中滴加2滴檢識液，觀察現(xiàn)象。

1.2.6 咖啡因紅外圖譜檢測 分別將干燥的咖啡因標(biāo)準(zhǔn)品與菊苣根咖啡因提取物粉末與溴化鉀混合在瑪瑙研缽中研磨均勻，經(jīng)壓片成薄片，在4000～400nm波長范圍內(nèi)進(jìn)行紅外光譜掃描，觀察譜峰情況。

1.2.7 菊苣根咖啡因提取物抑菌活性的研究 將培養(yǎng)基制成平板［12］，酵母和霉菌用馬鈴薯培養(yǎng)基，細(xì)菌用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，各菌種用無菌生理鹽水配制成107～108CFU/mL孢子懸液，吸取0.2mL孢子懸液均勻涂抹到滅菌的平板上，將3片浸有菊苣根咖啡因提取物的濾紙片均勻貼在每個涂有菌液的平板上，酵母和霉菌培養(yǎng)在28℃下48h，細(xì)菌培養(yǎng)在36℃下24h。以無菌水做空白對照，觀察抑菌效果，測定抑菌圈直徑。以上操作均在無菌條件下進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 檢測波長的選擇

按1.2.4步驟操作，二者均在274nm處有最大吸收波長，此處為生物堿絡(luò)合物的特征吸收峰(如圖1)。280nm處無紫外吸收，說明無蛋白質(zhì)吸收峰，在260nm處無吸收峰，說明無核酸存在。故選擇咖啡因檢測波長為274nm。

圖1 紫外光譜分析結(jié)果圖Fig.1 The UV spectral analysis result

2.2 咖啡因的檢識結(jié)果

按1.2.5步驟操作，當(dāng)向待測液中滴加2滴檢識液后，燒杯中出現(xiàn)難溶的橙紅色絡(luò)合物，表明試樣液中存在咖啡因成分的。

2.3 咖啡因的紅外光譜圖分析

菊苣根咖啡因提取物紅外光譜圖(圖3)經(jīng)數(shù)據(jù)庫檢索后與咖啡因標(biāo)準(zhǔn)品紅外圖譜(圖2)特征峰基本符合，圖譜解析如下:3424cm－1為酰胺鍵中N－H的伸縮振動產(chǎn)生的吸收峰;2963cm－1為甲基的C－H伸縮振動產(chǎn)生的吸收峰;1659cm－1為碳碳雙鍵－C=C－伸縮振動產(chǎn)生;1653cm－1為叔酰胺中－C=0的伸縮振動產(chǎn)生;1431cm－1為甲基的C－H彎曲振動產(chǎn)生，由于氮原子與甲基相連，吸收帶向高波數(shù)位移明顯;C－N 伸縮振動位于 1350～1100cm－1，與芳環(huán)碳或不飽和碳相連的C－N伸縮振動位于1350～1250cm－1，咖啡因結(jié)構(gòu)中C－N還連有甲基，甲基是供電子基，使C－N向高波數(shù)位移。由譜圖可知待測物結(jié)構(gòu)中含有以上特征基團(tuán)，與國家藥典文獻(xiàn)報(bào)道的咖啡因結(jié)構(gòu)中的基團(tuán)一致［13］。

圖2 咖啡因標(biāo)準(zhǔn)品紅外圖譜Fig.2 IR spectra of caffeine standard

圖3 菊苣根咖啡因提取物紅外圖譜Fig.3 IR spectra of caffeine extract ion of chicory root

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

由圖4、圖5可知，純品咖啡因的保留時間為3.787min，得到回歸方程為 y=32199x－1.4E+5，R2=0.9995，表明咖啡因進(jìn)樣量在25～125μg/mL范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系。

圖4 咖啡因標(biāo)準(zhǔn)品HPLC色譜圖Fig.4 HPLC chromatogram of caffeine standard

圖5 咖啡因標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.5 Caffeine standard curve

2.5 樣品分析

菊苣根咖啡因提取物色譜圖(見圖6)保留時間為3.79min，與標(biāo)準(zhǔn)品保留時間基本一致，證明樣品中存在咖啡因，根據(jù)高效液相定量結(jié)果所得菊苣根咖啡因含量為2.14mg/g。

2.6 重現(xiàn)性測定

取樣品5份，按照提取工藝制備樣品溶液，在上述色譜條件下進(jìn)行測定，結(jié)果表明該方法重現(xiàn)性良好，計(jì)算RSD值為0.272%。

2.7 回收率實(shí)驗(yàn)

圖6 菊苣根提取物HPLC色譜圖Fig.6 HPLC chromatogram of caffeine extraction

同一樣品分別精密加入不同量咖啡因標(biāo)品，按上述色譜條件測定回收率，詳見表1。結(jié)果表明，回收率在97.9%～100.9%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD為0.621%。

表1 回收率實(shí)驗(yàn)Table 1 Recovery experiment

2.8 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

取同一濃度樣品按上述色譜條件，分別在0、1、2、3、4h取10μL進(jìn)樣，分析結(jié)果表明，咖啡因提取物在4h之內(nèi)峰面積變化很小，穩(wěn)定性良好，其相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD=0.92%。詳見表2。

表2 樣品穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 Experiment results of the sample stability

2.9 菊苣根咖啡因提取物的抑菌活性

通過5次平行實(shí)驗(yàn)，由表3可見提取物對枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)的抑制作用最強(qiáng)，抑菌直徑可達(dá)到27mm;對大腸埃希菌(Echerichia coli)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、釀酒酵母(Saccharomyces)和青霉菌(Penicillium sp.)均有較強(qiáng)的抑制作用，抑菌直徑在18～24mm。由此可以說明菊苣根咖啡因提取物對5種常見的污染食品菌均有良好抑制作用。

3 結(jié)論

伴隨著生活條件的提高，人們對健康越來越重視，人們對綠色食品的追求愈加強(qiáng)烈，菊苣已經(jīng)成為國際上熱門的功能性食品。本研究利通過紫外全波長掃描確定咖啡因在274nm處有最大吸收波長，利用紅外圖譜與高效液相色譜法對菊苣根咖啡因提取物進(jìn)行定性及定量分析，結(jié)果表明該方法所得產(chǎn)品的性質(zhì)及結(jié)構(gòu)與咖啡因標(biāo)準(zhǔn)品結(jié)構(gòu)基本吻合。該方法具有操作快速、簡便、精密度好、準(zhǔn)確度高的特點(diǎn)，為今后菊苣根咖啡因大規(guī)模生產(chǎn)及其產(chǎn)品的深加工提供了可行性依據(jù)，對菊苣根綜合利用及功能性產(chǎn)品的開發(fā)具有潛在的工業(yè)生產(chǎn)和應(yīng)用價(jià)值。

表3 菊苣根咖啡因提取物抑菌效果Table 3 Antibacteria effect of caffeine extraction of chicory root

用枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、大腸埃希菌(Echerichia coli);青 霉 菌(Penicillium sp)、釀 酒 酵 母(Saccharomyces)檢驗(yàn)菊苣根咖啡因提取物抑菌活性，結(jié)果表明菊苣根咖啡因提取物對5種常見的污染食品菌均有良好的拮抗作用，為開發(fā)天然、溫和、安全、高效、綠色的食品防腐劑的研究奠定了基礎(chǔ)，具有很好的開發(fā)前景。由于本實(shí)驗(yàn)中菊苣根咖啡因提取物未經(jīng)純化分離，因此不排除與菊苣根乙醇提取物中其他的抗菌物質(zhì)具有協(xié)同增效作用。

［1］何軼，郭亞健，高云艷.菊苣根化學(xué)成分的研究［J］.中國中藥，2002，27(3):210－212.

［2］Sanderson M A.Nutritive value of chicory and English plantain forage Crop Science［J］.Crop Science Society of America，2003，43(5):1747－1804.

［3］羅惠善.人工栽培菊苣根水提取物的降壓、利尿作用的研究［J］.中華實(shí)用醫(yī)藥，2010，29(5):124－152.

［4］Fredholm BB，Battig K，Holman J，et al.Actions of caffeine in the brain with special reference to factors that contribute to its widespread use［J］.Pharmacol Rev，1999，51(1):82－133.

［5］Brice C，Smith A.The effects of caffeine on simulated driving，subjective alertness and sustained attention［J］.Hum Psychopharmacol，2001，16(7):523－531.

［6］Smith A P，Maben A，Brockman P.The effects of caffeine and evening meals on sleep and performance，mood and cardiovascular functioning the following day［J］.J Psychopharmacol，1993，7:203－206.

［7］嚴(yán)贊開.咖啡因的抑菌實(shí)驗(yàn)［J］.中國農(nóng)學(xué)通報(bào)，2004，20(3):65－66.

［8］侯冬巖，回瑞華.高效液相色譜法測定黑茶中咖啡因含量［J］.食品科學(xué)，2009，30(20):283－285.

［9］邵金良，黎其萬.離心萃取法測定茶葉中的咖啡因［J］.食品與機(jī)械，2010，26(4):78－80.

［10］劉曉庚，朱珊.茶葉中咖啡因提取方法的比較［J］.中國食品添加劑，2010(4):83－87.

［11］楊言言，張鐵銘.紫外分光光度法測定安徽羅漢尖老茶中咖啡因含量［J］.安徽中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2012，31(3):72－73.

［12］黃秀梨.微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)［M］.北京:高等教育出版社，1994:35－115.

［13］中華人民共和國衛(wèi)生部藥典委員會.中華人民共和國藥典［S］.第二部.北京:中國醫(yī)藥科技出版社，2010:461－462.