許愛清，周士鐳，馮杏杏，羅玉金，吳禹恒

(湖南科技大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，湖南湘潭411201)

墨魚(烏賊，Sepia officinalis)是一種名貴的海產(chǎn)品，市場中主要有兩種產(chǎn)品形式:冰凍墨魚鮮品和鹽漬風干后的墨魚干制品。出于保鮮和安全的考慮，人們對冰凍墨魚的微生物檢測關(guān)注度較高，研究人員從意大利生產(chǎn)和馬來西亞進口冷凍墨魚中分離到嗜鹽性的副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus)［1－2］，認為冰凍墨魚是這種能引起消費者發(fā)生急性腸胃炎致病菌的重要載體;研究也發(fā)現(xiàn)依賴NaCl生長的假單胞菌(Pseudomonas)是葡萄牙產(chǎn)冰凍保鮮墨魚的主要腐敗菌［3］。墨魚干是新鮮墨魚經(jīng)過鹽漬蒸熟、晾曬風干后制成的墨魚制品，在市售墨魚干表面常見有鹽漬菌斑，但是對干制墨魚產(chǎn)品的微生物檢測鮮見報道。本研究對菌斑中的耐(嗜)鹽細菌進行了分離純化，并對一株嗜鹽菌進行了系統(tǒng)發(fā)育分析，檢測了其部分生物學(xué)特性。研究結(jié)果能為了解墨魚干表面菌斑中微生物種類與特性，以及對其生長的控制提供參考，有助于提高墨魚干產(chǎn)品的品質(zhì)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

墨魚干，表面有明顯的白霜狀鹽漬菌斑 市售;含5%NaCl培養(yǎng)基:0.5%蛋白胨，0.5%牛肉膏，5%NaCl，自來水配制，pH 自然，121℃ 滅菌25min。制備固體培養(yǎng)基時需添加2%的瓊脂粉;含TaKaRa Taq(5U/μL)和10 × PCR 緩沖液(含 MgCl2，15mmol/L)的TaKaRa TaqTMDNA多聚酶試劑盒 寶生物工程(大連)有限公司;dNTPs(各 2.5mmol/L)、16S rDNA PCR通用引物:27F(5′－AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG－3′)、1492R(5′－GGY TAC CTT GTT ACG ACT T－3′) 北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責任公司;其它試劑均為進口或國產(chǎn)分析純。

MycyclerTMThermal Cycler PCR 儀、PowerPacTMBasic電泳儀 美國Bio－Rad公司;Kodak Gel Logic 212凝膠成像系統(tǒng) Carestream Health INC.USA;752型紫外可見分光光度計 上海光譜儀器有限公司;CT15RT通用冷凍離心機 上海天美(Techcomp)公司;SP500自動高壓蒸汽滅菌器 日本Yamato公司;SPX－250BS－II生化培養(yǎng)箱 上海新苗醫(yī)療器械制造公司;江南YS100生物顯微鏡 南京江南永新光學(xué)有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 嗜鹽菌的分離純化 取一片完整的墨魚干，刮取其帶白霜部位表面碎屑少許，懸浮于含5%NaCl液體培養(yǎng)基，25℃，150r/min振蕩培養(yǎng)24h富集耐鹽細菌。制成的菌懸液經(jīng)適度稀釋，涂布于含5%NaCl培養(yǎng)基固體平板，25℃培養(yǎng)48h，挑取單菌落，繼續(xù)劃線分離純化后，轉(zhuǎn)接到含5%NaCl培養(yǎng)基斜面，4℃保存。

1.2.2 菌株的形態(tài)學(xué)觀測 移取5%NaCl液體培養(yǎng)基中菌體制成涂片，經(jīng)石碳酸復(fù)紅單染色，普通光學(xué)顯微鏡油鏡下觀測菌體形態(tài)。

1.2.3 耐鹽度測定 液體菌種是將斜面上菌苔轉(zhuǎn)接到含5%NaCl液體培養(yǎng)基，25℃、150r/min振蕩培養(yǎng)24h的菌懸液。菌種稀釋液組成為用0.5%蛋白胨和0.5%牛肉膏的去離子水溶液。將液體菌種稀釋100倍以降低菌種液的鹽度，再按1%量接種于NaCl濃度為 0%、0.5%、1%、2%、3%、5%、8%、10%、12%、15%、20%、25%、30%和32%的液體培養(yǎng)基，25℃、150r/min振蕩培養(yǎng)24～48h，觀察比較菌懸液的渾濁度，評判菌的生長狀態(tài)。

1.2.4 16S rRNA基因序列分析 將受試菌株培養(yǎng)于含5%NaCl液體培養(yǎng)基后，離心收集菌體細胞，通過SDS堿裂解法抽提細菌基因組DNA［4］，以1.0%瓊脂糖電泳檢驗 DNA純度，－20℃保存?zhèn)溆?。?6S rDNA通用引物27F和1492R進行PCR擴增菌株16S rRNA基因。PCR反應(yīng)體系:10×PCR Buffer(Mg2+Plus)5.0μL、dNTPs(各 2.5mmol)1.0μL、引物27F(20μmol/L)和 1492R(20μmol/L)各 1.0μL、TaKaRa Taq(5U/μL)0.25μL、DNA 模板 1.0μL，補加滅菌蒸餾水至50μL。PCR擴增反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性 4min;然后 95℃ 變性 50s，52℃ 退火 1min，72℃延伸2min，共30個循環(huán);最后72℃延伸10min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖電泳檢測，純化后送交生工生物工程(上海)股份有限公司測序。雙向測定的16S rDNA序列合并后，通過 blastN(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)程序在GenBank中搜索比對相似序列，以 E值(Expectation values)＜1.0e－05為標準判別同源比對具有顯著性意義，指示兩者為同源序列。并通過 BankIt軟件提交序列到GenBank中。

參照 LPSN(ListofProkaryoticnameswith Standing in Nomenclature)數(shù)據(jù)庫中鹽單胞菌屬(Halomonas)和棲鹽田菌屬(Salinicola)的菌種名和模式菌株在GenBank/EMBL/DDBJ數(shù)據(jù)庫中的登錄號(http://www.bacterio.cict.fr/h/halomonas.html)，從GenBank的nucleotide數(shù)據(jù)庫中搜索選擇一些模式菌株的16S rDNA序列。所選擇的鹽單胞菌屬的模式菌株至少具有特征之一:分離自中國的鹽湖海水等環(huán)境中;分離來自韓國等傳統(tǒng)發(fā)酵海產(chǎn)食品基質(zhì);是耐鹽菌，在0%～20%NaCl鹽度下能生長。首先，將模式菌株與待測菌株的16S rDNA序列用ClustalW 1.83程序進行多序列比對;然后，利用分子進化遺傳分析軟件MEGA5.10構(gòu)建N－J系統(tǒng)發(fā)生樹(Neighbor－Joining tree)，基本參數(shù):系統(tǒng)發(fā)育樹可靠性檢驗的自舉值(Bootstrap Value)設(shè)定為1000次;替代模型(Substitution Model)選擇 Kimura 2－parameter model。以棕櫚發(fā)酵細菌(Zymobacter palmae)的模式菌株作外群［5］，分析待測菌株的系統(tǒng)發(fā)育地位。

1.2.5 溫度對菌株生長的影響 將新鮮菌液按1%接種量接種于含5%NaCl培養(yǎng)基中，置于5、10、15、25、37、42、45、50℃等溫度下，150r/min 振蕩培養(yǎng)24～72h，觀測比較培養(yǎng)液濁度。

1.2.6 硝酸鹽濃度的影響及硝酸鹽還原作用檢測含NaNO3培養(yǎng)基:0.5%蛋白胨，0.5%牛肉膏，按需要添加調(diào)整NaNO3的質(zhì)量百分比濃度，自來水配制，pH自然，121℃滅菌25min。

取5%NaCl液體培養(yǎng)基中新鮮菌種懸液，按1%接種量接種含NaNO3濃度為0.5%、1%、2%、3%、4%、5%、10%、15%的液體培養(yǎng)基，25℃，150r/min培養(yǎng)24～72h，測定菌株對硝酸鹽濃度的耐受性。

為檢測菌株生長過程中能否產(chǎn)生亞硝酸鹽，每12h移取含2%NaNO3培養(yǎng)液中菌懸液，經(jīng)10000×g離心去除菌體，向2mL上清液中依次加入100μL 0.4%對氨基苯磺酸溶液和100μL 0.2%鹽酸萘乙二胺溶液，溶液變?yōu)?粉)紅色則判定菌株能將硝酸鹽轉(zhuǎn)化成亞硝酸鹽(NaNO2)，即具有硝酸鹽還原作用為陽性;若該反應(yīng)為陰性，則往上清液中加少量鋅粉將硝酸根還原成亞硝酸根后，再根據(jù)顏色反應(yīng)來確認反應(yīng)結(jié)果［6］。

1.2.7 食品防腐劑的影響 參照在水產(chǎn)或肉制品中容許使用的防腐劑及其最大使用量［7］，選用食品級規(guī)格的山梨酸鉀(最大容許劑量為0.1%)、苯甲酸鈉(0.1%)、脫氫乙酸鈉(0.05%)、雙乙酸鈉(0.1%)、焦亞硫酸鈉(0.01%)和乳酸鏈球菌素(Nisin，0.05%)。在含5%NaCl培養(yǎng)基中分別添加各種防腐抑菌劑至最大容許劑量和對倍稀釋劑量，取5%NaCl培養(yǎng)液中菌種按1%量接種后，25℃，150r/min培養(yǎng)24～72h，觀測比較培養(yǎng)液濁度，檢測各種防腐劑的最小抑制濃度。

2 結(jié)果與討論

2.1 結(jié)果分析

2.1.1 菌株的形態(tài) 墨魚干表面碎屑在5%NaCl液體培養(yǎng)基中富集培養(yǎng)24h，生長出較濃濁的菌懸液。經(jīng)涂布平板和單菌落劃線分離，得到一個耐鹽菌株NYJ01。它在5%NaCl固體培養(yǎng)基上，28℃、48h生長的菌落形態(tài)和顯微鏡(油鏡)下的菌體形態(tài)見圖1。菌落呈乳白色、隆起、邊緣整齊、菌落直徑 0.5～1.5mm。菌體細胞為球狀或短桿狀，單個排列。

圖1 菌株NYJ01的菌落和細胞形態(tài)Fig.1 Morphology of colony and cells of the strain NYJ01

2.1.2 16S rRNA基因序列分析 對菌株NYJ01的16S rDNA進行PCR擴增，PCR產(chǎn)物測序得到1462nt核苷酸序列，在 GenBank中提交的登錄號是KC854246。將序列在GenBank數(shù)據(jù)庫進行BLAST搜索比對，結(jié)果表明它與鹽單胞菌屬和棲鹽田菌屬中一些菌株的16S rDNA序列的一致性高達99%。選擇這兩個屬中模式菌株與菌株NYJ01的16S rDNA序列構(gòu)建出的系統(tǒng)發(fā)育樹如圖2所示。系統(tǒng)發(fā)育分析顯示菌株NYJ01與棲鹽田菌屬細菌聚類為一個分枝，尤其是與該屬的模式菌株關(guān)聯(lián)棲鹽田菌(Salinicola socius)之間的親緣關(guān)系最近。因此，可以確定菌株NYJ01是一種棲鹽田菌，暫定為Salinicola sp.NYJ01。

2.1.3 菌株的部分生理特性 菌株Salinicola sp.NYJ01的耐鹽性測定結(jié)果顯示:在同樣接種量的情況下，在僅含NaCl為無機鹽的牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中，1%～20%NaCl范圍內(nèi)都能生長，最適范圍是3%～10%NaCl，其菌懸液最渾濁，可見大量的細胞凝聚團塊。菌株的耐鹽性表明菌株NYJ01是一種中度嗜鹽菌。

菌株NYJ01的生長溫度范圍是10～45℃，其最適范圍是25～37℃。在25℃以下，菌體生長緩慢，尤其是在10℃左右時，經(jīng)72h振蕩培養(yǎng)后培養(yǎng)液濁度無明顯變化。結(jié)果表明菌株NYJ01是一種中溫菌，可以利用10℃以下低溫抑制其生長繁殖。

表1 菌株NYJ01與鹽田菌屬細菌的部分表型特性對照Table 1 Differential phenotypic characteristics of the strain NYJ01 and the close related Salinicola species

圖2 基于16S rRNA基因構(gòu)建的N－J系統(tǒng)發(fā)育一致樹Fig.2 Neighbor－joining phylogenetic consensus tree based on the 16S rRNA gene sequences

菌株NYJ01能在僅含0.5%～15%NaNO3為無機鹽的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)液中生長。含NaNO3培養(yǎng)液離心后，上清液中加入亞硝酸鹽測定試劑，溶液不變紅色，表明它不能將硝酸鹽還原成亞硝酸鹽，即硝酸鹽還原作用陰性。可以推斷菌株在高鹽食品基質(zhì)上生長，不會引起亞硝酸鹽危害。

菌株NYJ01與鹽田菌屬細菌的部分表型特性列舉見表1。對照結(jié)果表明菌株NYJ01與同屬的4個模式菌株在生理特性上不完全相同，可能是一種新種或者是變種。

2.1.4 食品防腐劑對菌株生長的影響 選用6種食品級規(guī)格的防腐劑，以食品添加劑使用標準［7］中最大容許使用量為上限，經(jīng)對倍稀釋處理后，添加到5%NaCl牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中，接種NYJ01，25℃培養(yǎng)72h的后，菌體細胞的生長情況見表2。

表2 食品防腐劑對菌株NYJ01生長的影響Table 2 Effect of some food preservatives on the growth of strain NYJ01

表2數(shù)據(jù)表明:在食品中添加的最大容許劑量下，焦亞硫酸鈉(0.01%)和乳酸鏈球菌素(Nisin，0.05%)不能抑制菌株NYJ01生長;而其它幾種食品防腐劑在最大容許劑量下都能抑制菌株NYJ01生長，并且在對倍稀釋后都有不同程度的抑制作用?？衫?.025%雙乙酸鈉、0.05%山梨酸鉀、0.05%苯甲酸鈉或0.05%脫氫乙酸鈉分別抑制菌株NYJ01生長。

2.2 討論

2.2.1 耐鹽菌NYJ01的分類地位 本次分離所得菌株NYJ01的16S rDNA序列與鹽單胞菌屬和棲鹽田菌屬的一些菌株一致性達到99%。鹽單胞菌屬廣泛分布于含鹽環(huán)境，如海水、鹽湖、鹽田或人工鹽水。在伯杰氏手冊中僅描述了23種［8］。近年來，陸續(xù)發(fā)現(xiàn)鹽單胞菌屬中的很多新種，最新發(fā)布的鹽單胞菌屬中已有 83個有效菌種名(http://www.bacterio.cict.fr/h/halomonas.html)。就細胞形態(tài)和分離基質(zhì)來說，僅有鹽脫氮鹽單胞菌(H.halodenitrificans)為球狀或短桿狀，最初分離自腌肉的鹽水中;食物鹽單胞菌(H.alimentaria)是球狀或短桿狀，分離自韓國傳統(tǒng)發(fā)酵海產(chǎn)品(jeotgal，飛翅魚)［9］。除菌體形態(tài)相似，在細菌耐鹽性和生長溫度范圍方面，菌株NYJ01與上述分離自食品基質(zhì)的中度嗜鹽菌有明顯的不同。系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果表明，在國內(nèi)分離所得的十多種鹽單胞菌屬細菌在系統(tǒng)發(fā)育樹上分布比較離散，菌株NYJ01與該屬的鹽漬鹽單胞菌(H.salaria)具有最近的親緣關(guān)系，但該種已經(jīng)轉(zhuǎn)變?yōu)闂}田菌屬新種［10］。

棲鹽田菌屬是一個2007年建立的新屬［11］。屬的模式種是關(guān)聯(lián)棲鹽田菌，其它有效種包括鹽棲鹽田菌和嗜鹽棲鹽田菌(S.halophilus)［10］，以及中國學(xué)者(2013年)從養(yǎng)雞場土壤中分離鑒定的新種——澤澍棲鹽田菌(S.zeshunii)［12］。系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果表明，菌株NYJ01與該屬的所有模式菌株聚類為一個分枝，而且與模式種關(guān)聯(lián)棲鹽田菌之間的親緣關(guān)系最近。菌株NYJ01是棲鹽田菌屬的成員之一，但由于在部分生理特性方面，它又與4種棲鹽田菌之間不完全相同。因此，菌株NYJ01是否是棲鹽田菌屬的一個新種或變種，需要做詳盡的生理生化實驗才能予以確定。

2.2.2 耐鹽菌NYJ01在墨魚干上的功能 墨魚(烏賊)作為一種營養(yǎng)和藥用價值較高的海產(chǎn)品，生產(chǎn)加工的墨魚干產(chǎn)品會不可避免地攜帶海生的耐鹽微生物，因此，在墨魚干產(chǎn)品表面經(jīng)?？梢姷禁}漬白斑。本次鑒定的嗜鹽菌菌株NYJ01，分離自墨魚干帶菌斑的表面，表明該菌與菌斑的形成存在一定關(guān)聯(lián)。菌株NYJ01生長的營養(yǎng)要求簡單，適應(yīng)性強，耐鹽范圍和溫度范圍都比較廣泛，只要提供適宜溫度和鹽度，就能大量生長繁殖。一方面，如果認為該菌是墨魚干產(chǎn)品的污染菌而有必要控制其生長繁殖，本研究提供了一些基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，即可以使用食品防腐劑，例如0.025%雙乙酸鈉、0.05%山梨酸鉀、0.05%苯甲酸鈉或0.05%脫氫乙酸鈉分別抑制菌株NYJ01生長。還可以采用10℃以下的低溫控制這種細菌的生長繁殖。

另一方面，可以認為墨魚干產(chǎn)品表面生長耐鹽菌是一種自然發(fā)酵過程。迄今未見到因食用有嗜鹽菌生長(或污染)的墨魚干而引起食品安全問題的報道。本實驗表明菌株NYJ01屬于硝酸鹽還原陰性細菌，它不會引起食品中亞硝酸鹽危害的問題，可以認為菌株NYJ01是一種食用安全風險較低的細菌。嗜鹽菌的生長過程中能產(chǎn)生大量蛋白酶和核酸酶，它們分解蛋白質(zhì)產(chǎn)生谷氨酸，以及促使核酸分解產(chǎn)生核苷酸，這可能與日常飲食中用墨魚干熬制的湯汁非常鮮美有關(guān)。此外，資料表明能適應(yīng)生存于相當廣泛鹽度范圍的嗜鹽菌，其對高鹽度的適應(yīng)機制之一是“胞內(nèi)有機溶質(zhì)策略”，即在細胞內(nèi)合成或積累大量的相容性溶質(zhì)分子，例如四氫嘧啶(ectione)和甜菜堿(glycine betaine)等，并將鹽排出細胞質(zhì)［13］。嗜鹽菌產(chǎn)生的四氫嘧啶等相容性物質(zhì)對蛋白質(zhì)和細胞結(jié)構(gòu)具有保護作用，它們是一類有待開發(fā)的極具潛力的功能食品添加劑［14］。就這方面來說，菌株NYJ01存在于墨魚干產(chǎn)品中則具有積極的意義。

3 結(jié)論

本實驗從市售墨魚干表面分離純化出一株嗜鹽菌NYJ01。通過16S rDNA測序和系統(tǒng)發(fā)育分析表明它是一種鹽田菌屬細菌(Salinicola sp.)。這種中度嗜鹽菌能在1%～20%NaCl濃度下生長，最適濃度是3%～10%NaCl;生長溫度范圍是10～45℃，最適溫度是25～37℃，可以利用10℃以下低溫抑制其生長繁殖;它不具有硝酸鹽還原作用，不會引起墨魚干制品產(chǎn)生亞硝酸鹽危害;可利用0.025%雙乙酸鈉、0.05%山梨酸鉀、0.05%苯甲酸鈉或0.05%脫氫乙酸鈉分別抑制菌株NYJ01生長。

［1］Bertini S，Bresciani C M，Tiberto M，et al.Microbiological control of frozen and thawed cuttlefish(Sepia officinalis)［J］.Italian Journal of Food Science，2004，16(2):255－260.

［2］頓玉慧，徐建設(shè)，吳海，等.進境凍墨魚中副溶血性弧菌的分離及鑒定［J］.口岸衛(wèi)生控制，2007，12(3):23－25.

［3］Vaz－ PiresP，SeixasP，Mota M，etal.Sensory，microbiological，physical and chemical properties of cuttlefish(Sepia officinalis)and broadtail shortfin squid(Illex coindetii)stored in ice［J］.LWT－Food Science and Technology，2008，41(9):1655－1664.

［4］J.薩姆布魯克，D.W 拉塞爾，黃培堂等.分子克隆實驗指南(第三版)上冊［M］.北京:科學(xué)出版社，2002.

［5］Long M R，Zhang D F，Yang X Y，et al.Halomonas nanhaiensis sp.nov.，a halophilic bacterium isolated from a sediment sample from the South China Sea［J］.Antonie van Leeuwenhoek，2013，Jan 13.

［6］趙兵，何紹江 .微生物學(xué)實驗［M］.北京:科學(xué)出版社，2002.

［7］中華人民共和國衛(wèi)生部.GB 2760－2011食品安全國家標準 食品添加劑使用標準［S］.北京:中國標準出版社，2011.

［8］Brenner D J，Krieg N R，Staley J T.Bergey’s manual of systematic bacteriology， 2ndedition， volume two， the Proteobacteria，Part B，the Gammaproteobacteria［M］.Springer，2005.

［9］Yoon J H，Lee K C，Kho Y H，et al.Halomonas alimentaria sp.nov.，isolated from jeotgal，a traditional Korean fermented seafood［J］.International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology，2002，52:123－130.

［10］De La Haba R R，Sánchez－Porro C，Márquez M C，et al.Taxonomic study of the genus Salinicola:transfer of Halomonas salaria and Chromohalobacter salarius to the genus Salinicola as Salinicola salarius comb.nov.and Salinicola halophilus nom.nov.，respectively［J］.InternationalJournalofSystematic and Evolutionary Microbiology，2010，60:963－971.

［11］Anan’ina L N，Plotnikova E G，Gavrish E Yu，et al.Salinicola socius gen.nov.，sp.nov.，a moderately halophilic bacterium from a naphthalene－utilizing microbial association［J］.Microbiology，2007，76(3):324－330.

［12］Li C，Yan Q，Ni H，et al.Salinicola zeshuniisp.nov.，a moderately halophilic bacterium isolated from soil of a chicken farm［J］.Current Microbiology，2013，66:192－196.

［13］Oren A.Microbiallife athigh saltconcentrations:phylogenetic and metabolic diversity［J］.Saline Systems，2008，4:2.

［14］Lentzen G，Schwarz T.Extremolytes:natural compounds from extremophiles for versatile applications［J］.Applied Microbiology and Biotechnology，2006，72:623－634.