秦娜娜，侯偉偉，張雙雙，李天蘭，李 可，楊海燕

(新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與藥學(xué)學(xué)院，新疆烏魯木齊830052)

目前，中國有馬近 892×104匹，居世界第一［1］。新疆有馬102.5×104匹，與內(nèi)蒙古(108.4×104匹)相近，居全國第二［2］。生馬骨中蛋白質(zhì)和脂肪含量分別為12.8%和8.5%，骨中含有構(gòu)成蛋白質(zhì)的所有氨基酸，且比例均衡、必需氨基酸水平高，屬于優(yōu)質(zhì)蛋白［3－4］。人們通過對酶解機(jī)理、酶解原料、酶及酶解液等方面進(jìn)行了大量的深入研究［5］，發(fā)現(xiàn)酶法水解優(yōu)點(diǎn)體現(xiàn)在溫和，易控、有定向、反應(yīng)時間短，無環(huán)境污染，產(chǎn)品營養(yǎng)價值高等。利用可控酶解技術(shù)水解骨蛋白，作為保健品的重要基料，具有良好的加工特性、營養(yǎng)功能和生理活性，符合當(dāng)前消費(fèi)者對畜禽產(chǎn)品“天然、營養(yǎng)、安全、健康”的消費(fèi)趨勢［6－8］。在國內(nèi)對骨的利用還停留在落后階段，只是將骨熬湯，制成骨膠等食品添加劑［9］。近些年隨著消費(fèi)觀念的轉(zhuǎn)變，“以骨補(bǔ)骨”的意識不斷增強(qiáng)，骨食品在研發(fā)方面取得了明顯的成績。在國外骨食品的開發(fā)已經(jīng)很普遍，采用超微粉碎技術(shù)生產(chǎn)食用骨粉、骨糊、骨膠、骨漿、骨肉蛋白粉及骨提取物等各種骨產(chǎn)品及高質(zhì)量蛋白質(zhì)。本實(shí)驗(yàn)以氮收率和水解度為指標(biāo)，在單因素基礎(chǔ)上，采用二次旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計實(shí)驗(yàn)優(yōu)化最佳酶解工藝條件［10］。針對熏馬肉、熏馬腸中剩余副產(chǎn)物馬骨進(jìn)行綜合利用，形成具有較高副加值產(chǎn)品，這樣不僅可以減少骨資源的浪費(fèi)，獲得更大的經(jīng)濟(jì)效益，更重要的是通過加工工藝的改進(jìn)，豐富了消費(fèi)者食材。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

生馬骨 新疆霍城縣馬產(chǎn)業(yè)基地;胃蛋白酶、堿性蛋白酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶 南寧龐博生物技術(shù)有限公司;正己烷、濃硫酸、氫氧化鈉 天津市福晨化學(xué)試劑廠;硫酸銅、硫酸鉀 天津市化學(xué)試劑三廠;甲基紅指示劑(C15H15N3O2)、溴甲酚綠指示劑(C21H14Br4O5S)等 均為分析純。

AL204－1C電子分析天平 梅特勒托利多儀器有限公司;HH－2型數(shù)顯恒溫水浴鍋 上海博迅實(shí)業(yè)有限公司;凱氏定氮裝置 四川(崇州)蜀玻有限公司;TDL－5離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠;pH計 德國Sartorius公司;PL3000真空冷凍干燥儀 Thermo公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 水解度的測定方法 鄰苯二甲醛滴定法［11］。水解度(%)=水解液中的總游離氨基酸態(tài)氮含量/原料中的總氮量×100

1.2.2 氮收率的測定方法［12］根據(jù)公式計算氮收率:氮收率(%)=水解液中蛋白含量/原料中蛋白質(zhì)含量×100

1.2.3 工藝流程

1.2.4 酶種類的篩選 根據(jù)酶切位點(diǎn)的不同，分別采用堿性蛋白酶、胰蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶及胃蛋白酶在其各自的最適溫度、pH條件下，料液比 1∶6g/mL、加酶量 6000U/g、酶解時間 4h，對馬骨蛋白進(jìn)行水解，以水解度、氮收率來確定最佳用酶。

1.2.5 單因素實(shí)驗(yàn) 確定酶解溫度、料液比、pH、加酶量、時間五個因素，對氮收率和水解度的影響。

1.2.6 響應(yīng)面法優(yōu)化酶解工藝 在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，運(yùn)用Box－Behnken的中心組合設(shè)計原理，在酶解時間已經(jīng)確定的基礎(chǔ)上，以水解度為響應(yīng)值，選擇酶解溫度、料液比、pH、加酶量，進(jìn)行四因素三水平響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)［10］。見表 1。

表1 實(shí)驗(yàn)因素水平表Table 1 The factor and level of test

2 結(jié)果與分析

2.1 酶種類的篩選結(jié)果

由圖1可知，馬骨粉未加酶的水解度和氮收率較低，添加酶后都有增加，其中堿性蛋白酶水解度、氮收率均最高，分別為:14.41%、68.25%，因此選擇堿性蛋白酶為水解用酶。5種不同蛋白酶對馬骨粉水解的影響順序?yàn)?堿性蛋白酶＞胃蛋白酶＞胰蛋白酶＞中性蛋白酶＞木瓜蛋白酶。

圖1 酶種類的篩選Fig.1 Select about the types of the enzyme

2.2 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 溫度對酶解的影響 由圖2可知，隨著酶解溫度的增加水解度和氮收率都增加，50℃時數(shù)值最大，大于50℃其數(shù)值有顯著下降趨勢。因?yàn)?，低于酶的最適溫度，酶的活性比較小，高于酶的最適溫度會導(dǎo)致酶部分或全部失活，酶活力會迅速下降［13］。

圖2 溫度對酶解的影響Fig.2 The influence of temperature on enzymatic hydrolysis

2.2.2 料液比對酶解的影響 由圖3可知，馬骨粉酶解液的水解度和氮收率都是伴隨著料液比的不斷降低呈上升的趨勢，這主要是因?yàn)榱弦罕仍酱?，酶和底物接觸不充分，造成樣品中堿性蛋白質(zhì)酶解不完全。料液比越小，堿性蛋白酶和底物接觸的位點(diǎn)越充分，但是如果馬骨粉酶解液中可溶性的固形物含量太低，則不利于酶解液的冷凍干燥。因此，結(jié)合實(shí)際情況，選擇適宜的料液比為1∶6g/mL。

圖3 料液比對酶解的影響Fig.3 The influence of solid－liquid ratio on enzymatic hydrolysis

2.2.3 pH對酶解的影響 pH是影響酶活力的重要因素之一，因?yàn)槊敢l(fā)揮其催化功能，活性基團(tuán)部位必須有一定的解離形式。pH會影響酶分子的構(gòu)象和酶分子及底物的解離狀態(tài)，從而影響酶活性和酶促反應(yīng)速度，pH過高或過低都不利于酶解反應(yīng)。由圖4可知，pH為9時馬骨粉的水解度和氮收率最高。低于最適pH酶活力比較小，高于最適pH酶部分失活或全部失活，導(dǎo)致水解度和氮收率均下降［14］。

圖4 pH對酶解的影響Fig.4 The influence of pH on enzymatic hydrolysis

2.2.4 加酶量對酶解的影響 由圖5可知，隨著加酶量的增加，馬骨粉的氮收率和水解度在增加，低于6000U/g水解度和氮收率增加較快，高于6000U/g增加緩慢。隨著加酶量的增加，酶與底物不斷增加位點(diǎn)接觸，加酶量在6000U/g時，酶與底物的接觸位點(diǎn)已經(jīng)比較充分，再增加酶用量其水解度和氮收率變化不大，因此選擇最適的加酶量為6000U/g。

圖5 加酶量對酶解的影響Fig.5 The influence enzymatic hydrolysis of enzyme

2.2.5 時間對酶解的影響 由圖6可知，隨著酶解時間的延長，水解度和氮收率顯著增加，4h時達(dá)最大值，大于4h趨于穩(wěn)定。因?yàn)槊附鈺r間過短，蛋白水解不完全，隨時間的延長，蛋白充分酶解，當(dāng)酶解達(dá)到最大，增加酶解時間不會增加水解程度。因此，選擇酶解時間為4h最佳。

圖6 時間對酶解的影響Fig.6 The influence of time on enzymatic hydrolysis

2.2.6 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計結(jié)果 運(yùn)用Design Expert8.0Trial設(shè)計，展開29組實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見表2。

根據(jù)表3所得的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，運(yùn)用Design Expert8.0 Trial統(tǒng)計軟件進(jìn)行處理，采用響應(yīng)曲面統(tǒng)計方法對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合，建立酶解溫度、料液比、酶解pH與加酶量四因子的二次多項數(shù)學(xué)回歸方程:

Y=18.40－2.63X1+0.53X2－0.092X3+0.7X4+0.55X1X2－0.42X1X3+0.15X1X4+0.72X2X3－1.62X2X4+0.13X3X4－2.26X12－1.72X22－2.31X32－1.75X42

進(jìn)一步對該回歸模型的顯著性進(jìn)行檢驗(yàn)，響應(yīng)曲面的數(shù)據(jù)方差分析結(jié)果見表3，分析結(jié)果顯示模型的 F=59.36＞F0.05(14，14)=2.48，p＜0.0001，表明回歸模型極顯著。失擬項 F=1.92＜F0.05(14，10)=2.60，p=0.2776＞0.05，不顯著，說明該模型擬合程度良好，實(shí)驗(yàn)誤差小。因此，可以選擇用此模型來分析和預(yù)測酶解法制取馬骨營養(yǎng)多肽粉的工藝結(jié)果。同時一次項 X1、X2、X4極顯著，交叉項 X2X3、X2X4極顯著、X1X2顯著，平方項值都是極顯著性影響。最佳實(shí)驗(yàn)結(jié)果:酶解溫度47.1℃，料液比1∶6.98g/mL，酶解pH9.02，加酶量6180U/g。結(jié)合實(shí)際操作條件，酶解溫度 47℃，料液比1∶7g/mL，酶解 pH9，加酶量6200U/g，此時最大的水解度為17.8%。

表2 Box－Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計及結(jié)果Table 2 The design and results of Box－Behnken

通過3組平行實(shí)驗(yàn)，檢驗(yàn)?zāi)Ｐ皖A(yù)測的準(zhǔn)確性。所得酶解最大水解度平均值為17.47%(誤差值小于0.05%)。建立的模型比較符合實(shí)際情況，響應(yīng)面法優(yōu)化酶解馬骨粉工藝參數(shù)可行。

2.2.7 響應(yīng)曲面模型結(jié)果分析 通過對模型的響應(yīng)面以及相對應(yīng)的等高線圖進(jìn)行分析，得出各因素的交互作用對酶解的影響和預(yù)測最優(yōu)值，并對模型的預(yù)測最優(yōu)值進(jìn)行驗(yàn)證，從而確定預(yù)處理工藝酶解的最佳條件。模型的響應(yīng)曲面及其等高線見圖7～圖9。

響應(yīng)曲面出現(xiàn)最高點(diǎn)，在等高線面具有橢圓形中心區(qū)域，說明因素在所選擇范圍內(nèi)能產(chǎn)生最佳的響應(yīng)值，因素的選擇在實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)合理并且有效，能夠反映出響應(yīng)值的影響趨勢。響應(yīng)曲面坡度較大，未出現(xiàn)最高點(diǎn);在等高線面上具有部分橢圓形中心區(qū)域，表明具有交互作用，但無最佳響應(yīng)值。極值條件應(yīng)在等高線的橢圓圓心處。由圖7～圖9和表3可知，酶解溫度與料液比對馬骨脫脂中總蛋白質(zhì)含量的交互作用顯著，料液比與pH、料液比與加酶量的交互作用極顯著。

表3 回歸模型方差分析及模型系數(shù)顯著性檢驗(yàn)Table 3 The Variance analysis and coefficients significant inspection of the model

圖7 Y=f(X1，X2)響應(yīng)曲面立體圖及等高線Fig.7 Response surface plot and contour map plot for Y=f(X1，X2)

圖8 Y=f(X2，X3)響應(yīng)曲面立體圖及等高線Fig.8 Response surface plot and contour map plot for Y=f(X2，X3)

3 結(jié)論

圖9 Y=f(X2，X4)響應(yīng)曲面立體圖及等高線Fig.9 Response surface plot and contour map plot for Y=f(X2，X4)

本實(shí)驗(yàn)以脫脂馬骨粉為原料，以水解度和氮收率為響應(yīng)值，對5種蛋白酶進(jìn)行比較，選擇堿性蛋白酶為水解用酶。在單因素的基礎(chǔ)上，通過二次旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計優(yōu)化最佳酶解工藝參數(shù)為:酶解溫度47℃，料液比 1∶7g/mL，酶解 pH9，加酶量 6200U/g，酶解時間4h，在該條件下水解度為17.47%。通過本實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)可以看出，酶解法可以顯著提高馬骨粉水解度和增加馬骨粉綜合利用。

［1］劉云.發(fā)展馬肉加工業(yè)大有可為［J］.食品工業(yè)，2004(6):31－32.

［2］甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)主編.養(yǎng)馬學(xué)［M］.北京:中國農(nóng)業(yè)出版社，1981.

［3］ZARKADAS C G，YU Z，ZARKADAS G C，et al.Assessment of the protein quality of bone isolates for use an ingredient in ment and poultry products［J］.J Agri Food Chem，1995，43(1):77－83.

［4］Field R A，Chang Y O，Kruggel W G.Protein quality of mechanically processed product and bone residue［J］.J Food Sci，1999，44(3):690－695.

［5］Ney K H.Hydrolysis of deliberated proteins［J］.Journal of Food Science，2002，24(3):87－89.

［6］王民樂.食品行業(yè)的經(jīng)濟(jì)背景、態(tài)勢與發(fā)展趨勢［J］.食品科學(xué)，2000(12):161－164.

［7］夏秀芳.畜禽骨的綜合開發(fā)利用［J］.肉類加工，2007(5):22－25.

［8］孫衛(wèi)青，馬麗珍，王芳.骨食品開發(fā)研究前景廣闊［J］.肉類工業(yè)，2001(1):43－44.

［9］徐俊華，王慧明.牛肌腱膠原蛋白的提取及多孔支架的制作［J］.中國口腔種植學(xué)雜志，2005(9):35－36.

［10］張曉娜，周素梅，王世平.二次回歸正交旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計對麥麩中阿拉伯木聚糖酶解工藝的優(yōu)化［J］.食品科學(xué)，2008，29(1):141－145.

［11］寧正祥.食品成分分析手冊［M］.北京:中國輕工業(yè)出版社，1998，119－124.

［12］翟永信.現(xiàn)代食品分析手冊［M］.北京:北京大學(xué)出版社，1988，176－239，277，342－356.

［13］楊銘鐸.豬骨呈味物質(zhì)提取的研究［I］:酶解豬骨最佳工藝條件［J］.食品科學(xué)，2007，28(9):210－215.

［14］賈冬英，趙宏銘，姚開，等.鰱魚頭及骨中蛋白質(zhì)的酶解條件優(yōu)化［J］.食品科技，2007(4):243－246.