劉 琴，牛文慧，張薇娜，胡秋輝

(南京財(cái)經(jīng)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，江蘇省糧油品質(zhì)控制及深加工技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇南京210046)

異黃酮(isoflavone)是一種弱的植物雌激素，而大豆是人類獲得異黃酮的主要途徑。已知大豆中的大豆異黃酮共有12種，包括染料木素(genistein，Ge)、大豆素 (daidzein，De)、黃豆黃素 (glycitein，GLe)及其相應(yīng)的糖苷結(jié)合形式、乙?；咸烟擒战Y(jié)合形式和丙二酰基葡萄糖苷結(jié)合形式，均為以3－苯丙吡喃酮為母核的化合物。臨床實(shí)驗(yàn)證明:作為一種主要的植物來源雌激素［1］，大豆異黃酮能有效預(yù)防和治療骨質(zhì)疏松［2］、更年期綜合癥［3］，具有降血糖［4］、抗高血脂［5］和抑制細(xì)菌生長(zhǎng)等［6］多種生物活性，此外，它們還具有黃酮類化合物普遍具有的抗氧化作用［7］，能降低慢性非傳染性疾病如心血管?。?］、糖尿?。?］及癌癥(特別是乳腺癌［10］和前列腺癌［11］)的發(fā)病率，因此大豆異黃酮已被用做臨床藥物和保健品。豆芽富含蛋白質(zhì)、纖維素、礦物質(zhì)及維生素，且具有熱量低，爽口等優(yōu)點(diǎn)，是深受中國(guó)、韓國(guó)、日本等亞洲老百姓的喜愛蔬菜。大豆芽中蛋白質(zhì)、異黃酮等營(yíng)養(yǎng)和功能性成分與大豆原料差異也引起了人們的研究興趣。于立梅［12］等研究表明，大豆中的蛋白質(zhì)、還原糖、VC和異黃酮含量在發(fā)芽后均較未發(fā)芽時(shí)增加。李振艷［13］等也報(bào)道了γ－氨基丁酸、大豆異黃酮等功能性因子含量在發(fā)芽過程中都有明顯提高。在有關(guān)大豆發(fā)芽過程中大豆異黃酮含量的變化的報(bào)道中，對(duì)大豆異黃酮的測(cè)定大都是用光度法，即測(cè)定的是大豆異黃酮總含量的變化，對(duì)于大豆發(fā)芽后異黃酮組成及在豆芽芽莖和子葉中的含量分布的研究還很少。本研究通過液質(zhì)聯(lián)用結(jié)合串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)，對(duì)大豆芽和大豆原料中異黃酮的總含量和組成進(jìn)行了比較研究，并對(duì)異黃酮在豆芽子葉和芽莖中的分布進(jìn)行了進(jìn)一步分析，該研究可為評(píng)價(jià)大豆芽作為一種餐桌上常見的蔬菜所具有的功能性提供基礎(chǔ)研究的數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

大豆原料于2011年10月一次性購(gòu)于江蘇省蘇果超市，產(chǎn)地東北，屬小粒種大豆(13.90g/百粒種重)。染料木苷標(biāo)品，色譜純甲醇、醋酸購(gòu)于Sigma－Aldrich公司;染料木素、大豆苷、大豆素、黃豆黃苷和黃豆黃素標(biāo)品均購(gòu)于阿拉丁試劑公司;其他分析純?cè)噭┵?gòu)于中國(guó)國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

FW－100型高速萬(wàn)能粉碎機(jī) 天津市華鑫儀器廠;SHA－B水浴恒溫振蕩器 金壇市榮華儀器制造有限公司;Allegra 64R高速冷凍離心機(jī) 美國(guó)貝克曼公司;Mill－Q Academic超純水系統(tǒng) 美國(guó) Mill Pore公司;FD－STD冷凍干燥機(jī) 美國(guó)Labconco公司;Agilent 1100 HPLC/MS(SL)型帶自動(dòng)進(jìn)樣器的高效液相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用儀 美國(guó) Agilent公司;Zorbax SB－C18型反相色譜柱(4.6mm×250mm，5μm) 美國(guó)Agilent公司;UV－2900紫外可見分光光度計(jì) 日本日立公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 豆芽的制作 選取大豆籽粒用清水漂洗后于27℃純水中浸泡8h，然后將大豆單層平鋪托盤中，并用紗布覆蓋，放入27℃左右的人工氣候箱中發(fā)芽。分別收集不同芽長(zhǎng)的豆芽測(cè)定其中大豆異黃酮總含量。選取芽長(zhǎng)為3cm的大豆，將其芽莖與子葉進(jìn)行分離，分別測(cè)定子葉和芽莖中的異黃酮組成［14］。

1.2.2 樣品預(yù)處理 將大豆原料、胚芽和子葉分別用粉碎機(jī)預(yù)粉碎，并用石油醚(30～60℃)做溶劑，用索氏抽提法除油后再次粉碎并過80目篩;不同芽長(zhǎng)的豆芽，豆芽芽莖和豆芽子葉樣品均經(jīng)冷凍干燥后，再用上述方法除油和粉碎。處理后的樣品置于4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 大豆異黃酮的提取 準(zhǔn)確稱取0.3g上述預(yù)處理后的樣品粉末，按料液比為1∶30(g/mL)，加入70%乙醇進(jìn)行提取，提取溫度為70℃，提取時(shí)間為3.0h。提取液用冷凍離心機(jī)離心后取上清液進(jìn)行大豆異黃酮分析。每個(gè)樣品進(jìn)行3次平行提取，之后的分析取3個(gè)平行提取液測(cè)定的平均值［15］。

1.2.4 分光光度法測(cè)定大豆異黃酮的總含量 以染料木素為標(biāo)準(zhǔn)品，配制不同濃度的染料木素溶液，測(cè)定它們?cè)?60nm下的吸光度，以濃度(mg/mL)為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為:y=121.58x+0.0184，R2=0.9991。以70%乙醇水溶液為空白，測(cè)定不同大豆異黃酮提取液在波長(zhǎng)為260nm下的吸光度值，帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程求出大豆異黃酮總含量，結(jié)果表示為mg(Ge當(dāng)量)/g(樣品干重)。

1.2.5 大豆異黃酮的組分鑒定 大豆異黃酮提取液中各個(gè)組分是根據(jù)液相洗脫過程中流出峰的紫外特征吸收，對(duì)應(yīng)的質(zhì)譜峰及其二級(jí)質(zhì)譜所得碎片峰進(jìn)行鑒定的。

液相色譜方法:以含0.1%HAc的水為流動(dòng)相A，含0.1%HAc的甲醇為流動(dòng)相 B，控制流速為0.5mL/min，柱溫為35℃，采用 Zorbax SB－C18反相色譜柱(4.6mm ×250mm，5μm)，按照如下梯度洗脫:0～20min，20% ～30%B;20～30min，30% ～35%B;30～40min，35% ～40%B;40～60min，40% ～80%B;60～65min，80% ～20%B;65～70min，20%B。采用DAD檢測(cè)器，檢測(cè)波長(zhǎng)為260nm。

質(zhì)譜條件:霧化氣N230Psi;干燥氣N210 mL/min;毛細(xì)管溫度為350℃，在正離子模式下控制毛細(xì)管電壓為3.5kV。掃描范圍:m/z 100～2000。二級(jí)質(zhì)譜:控制碰撞電壓使母離子的信號(hào)強(qiáng)度占峰度最高的子離子強(qiáng)度的20%。

根據(jù)不同大豆異黃酮標(biāo)品標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算不同提取液中各大豆異黃酮組分的含量，結(jié)果換算為mg/100g樣品干重。

1.2.6 數(shù)據(jù)處理 每組實(shí)驗(yàn)均做三組平行，用作實(shí)驗(yàn)分析的數(shù)據(jù)均表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。采用統(tǒng)計(jì)軟件SAS9.2進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，所有顯著性分析均基于α=0.05的顯著水平。

2 結(jié)果與分析

2.1 大豆芽在發(fā)芽過程中異黃酮總含量的變化

我們首先用分光光度法對(duì)原料和不同芽長(zhǎng)的豆芽中的大豆異黃酮總含量進(jìn)行了分析，結(jié)果見圖1。由圖1可見，大豆發(fā)芽后大豆異黃酮總含量增加了，大豆異黃酮總含量在豆芽芽長(zhǎng)3cm時(shí)達(dá)到最高。對(duì)大豆胚芽、大豆子葉、3cm豆芽芽莖和豆芽子葉中異黃酮總含量的比較(表1)表明，大豆胚芽中異黃酮總含量遠(yuǎn)高于大豆子葉;豆芽芽莖中的異黃酮總含量也明顯高于豆芽子葉，但低于大豆胚芽中的含量;而豆芽子葉中異黃酮含量略高于大豆子葉。

圖1 原料和不同芽長(zhǎng)的豆芽中大豆異黃酮總含量Fig.1 Total isoflavone contents in soybean and germinated soybean in different

2.2 HPLC/MS結(jié)合MS/MS分析大豆及豆芽中異黃酮的組成

為研究大豆發(fā)芽后異黃酮組成的變化，我們首先通過HPLC/MS結(jié)合MS/MS對(duì)各樣品的大豆異黃酮提取液進(jìn)行了分析，圖2為大豆原料、豆芽芽莖和豆芽子葉的大豆異黃酮提取物的液相色譜圖，表2給出了該圖中各色譜峰的保留時(shí)間、對(duì)應(yīng)的質(zhì)譜、二級(jí)質(zhì)譜碎片峰以及根據(jù)質(zhì)譜結(jié)果給出的對(duì)應(yīng)的大豆異黃酮。

表2 大豆異黃酮提取液中主要色譜峰的保留時(shí)間、質(zhì)荷比((m/z)、二級(jí)質(zhì)譜碎片峰和對(duì)應(yīng)的大豆異黃酮種類Table 2 Retention time，m/z value，fragments of MS/MS and corresponding isoflavone compounds of peaks recorded at HPLC chromatogram

表1 大豆和芽長(zhǎng)為3cm豆芽中大豆異黃酮的分布比較Table 1 Total isoflavone distribution in soybean and germinated soybean at lenghth of 3 cm

在液相色譜中共檢測(cè)到16個(gè)主要峰，11種異黃酮，其中9個(gè)為已知的大豆異黃酮成分，兩個(gè)為未知組分(峰4和峰6)，兩個(gè)未知組分的最大吸收波長(zhǎng)均為260nm，峰4的串聯(lián)質(zhì)譜的碎片峰的基峰為255.0，對(duì)應(yīng)于大豆素的正離子的m/z值，應(yīng)屬于大豆素類異黃酮，峰9串聯(lián)質(zhì)譜的基峰為271.1，對(duì)應(yīng)于染料木素的m/z值，應(yīng)屬于染料木素類異黃酮，這兩個(gè)化合物需進(jìn)一步鑒定。此外，這兩個(gè)組分只在豆芽芽莖中檢測(cè)到，在大豆原料和豆芽子葉中均未檢出。而乙?；惔蠖巩慄S酮未能在我們的樣品中檢出。

2.3 大豆及豆芽中各大豆異黃酮組分的含量及其分布

2.3.1 大豆異黃酮的標(biāo)準(zhǔn)曲線 按1.2.5中的色譜條件進(jìn)樣，以峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，標(biāo)準(zhǔn)品濃度(mg/mL)為橫坐標(biāo)(X)，分別得到染料木素、大豆素、黃豆黃素、大豆苷、染料木苷、黃豆黃苷的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程如表3所示。

圖2 大豆原料(a)，3cm豆芽芽莖(b)及3cm豆芽子葉(c)的大豆異黃酮提取液的HPLC色譜圖Fig.2 HPLC chromatogram of the isoflavone extractions from(a)soybean，(b)sprout and(c)cotyledon from germinated soybean respectively

表4 大豆原料及3cm豆芽中各大豆異黃酮組分的含量及在原料胚芽、子葉及豆芽芽莖和子葉中的分布Table 4 Content of isoflavone in different samples

表3 各標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線Table 3 Standard curves of isoflavone standards

2.3.2 大豆及豆芽中各大豆異黃酮組分的含量及其分布 為比較大豆發(fā)芽前后各異黃酮含量及分布的變化，我們分別以染料木素、大豆素、黃豆黃素、大豆苷、染料木苷、黃豆黃苷對(duì)大豆原料，大豆胚芽、大豆子葉、3cm豆芽芽莖、3cm豆芽子葉中的各大豆異黃酮組分的含量進(jìn)行了分析，其中丙二酰基染料木苷、丙二?；蠖管辗謩e以染料木苷和大豆苷為標(biāo)品進(jìn)行定量分析，結(jié)果見表4。由表4可以看到，與光度分析結(jié)果一致，大豆籽粒的胚芽中各大豆異黃酮組分含量及總含量均遠(yuǎn)高于大豆子葉，其中大豆胚芽中的大豆異黃酮總含量為大豆子葉中的11倍左右，與Kim［16］等人的研究相符，其中大豆苷(D)、丙二酰基大豆苷(MD)含量分別為子葉中含量的12和17倍以上;黃豆黃苷(GL)、丙二酰基黃豆黃苷(MGL)含量分別為子葉中的32倍和53倍;染料木素(Ge)和大豆素(De)在胚芽中的含量分別為子葉中的12倍和14倍左右。黃豆黃素(Gle)在胚芽中含量遠(yuǎn)高于染料木素的含量，但在大豆子葉中未能檢測(cè)到。

在豆芽中，豆芽芽莖中染料木苷(G)含量與豆芽子葉相近，丙二酰基染料木苷(MG)含量低于豆芽子葉外，其余各組分含量均顯著高于豆芽子葉中的含量，其中大豆苷(D)和丙二?；蠖管?MD)的含量分別為豆芽子葉中的5倍和4倍左右;黃豆黃苷(GL)、丙二?；S豆黃苷(MGL)和黃豆黃素(GLe)在豆芽子葉中均未能檢出，但在豆芽芽莖中的含量分別為86.94、132.16和14.05 mg/100g，高于染料木苷(G)、丙二?；玖夏拒?MG)和染料木素(Ge)的含量。豆芽子葉中各大豆異黃酮組分含量及總含量均高于大豆子葉，而豆芽芽莖中除大豆素(De)和黃豆黃素(GLe)外，其余各組分含量均顯著低于大豆胚芽中的含量。

在大豆胚芽和豆芽芽莖中，丙二?；蠖管盏暮孔罡?，在大豆胚芽中占大豆異黃酮總含量的46.79%，而在豆芽芽莖中占38.2%;在大豆子葉和豆芽子葉中丙二?；玖夏拒盏暮孔罡撸謩e占大豆異黃酮總含量的40.97% 和45.51%。在所有樣品中，丙二?；咸烟擒疹惍慄S酮含量均高于相應(yīng)的糖苷類，而苷元的含量最低。

圖3 不同樣品中各大豆異黃酮類別的干重百分含量Fig.3 Dry percentage of different isoflavones class in different samples

3 結(jié)論

對(duì)不同芽長(zhǎng)的大豆芽中大豆異黃酮含量研究表明，大豆發(fā)芽后異黃酮總含量逐漸增加，在芽長(zhǎng)為3cm時(shí)達(dá)到最高，其中芽莖中大豆異黃酮的總含量達(dá)到子葉的4倍以上，為大豆原料的2倍以上。由圖3可以看出，大豆和大豆芽不同部位的大豆異黃酮組成存在顯著差異，在大豆胚芽和豆芽芽莖中，大豆苷類(D+MD)異黃酮含量最高，其次是黃豆黃苷類(GL+MGL)，染料木苷類大豆異黃酮(G+MG)含量次之，苷元類(De+Ge+Gle)含量最低。在大豆、大豆子葉和豆芽子葉中則是染料木苷類大豆異黃酮(G+MG)含量最高，其次是大豆苷類(D+MD)。有研究表明［17］，在代謝過程中，大豆苷類異黃酮的生物可利用率高于染料木苷和黃豆黃苷類異黃酮，而異黃酮苷元的生物可利用度高于異黃酮糖苷和丙二?；咸烟擒疹惍慄S酮，我們的研究結(jié)果表明，豆芽芽莖中大豆異黃酮總含量，大豆苷類和苷元類異黃酮的含量顯著高于大豆原料和豆芽子葉，因此相比較大豆本身，大豆芽芽莖可能是一種好的大豆異黃酮的食品來源。

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