彭 真，程 琳，何艷軍，王 潔，關(guān)小燕，劉松瑜，盧 鋼

(浙江大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院園藝系，杭州 310058)

高溫嚴(yán)重影響植物的生長發(fā)育及生理代謝，已成為限制植物分布、生長和生產(chǎn)力的一個(gè)主要環(huán)境因子。大多數(shù)栽培作物(如番茄［1］、辣椒［2］、菜豆［3］、擬南芥［4］、水稻［5］、大麥［6］等)的生殖生長時(shí)期比營養(yǎng)生長時(shí)期對高溫更敏感，前人的研究表明這主要是因?yàn)榛ǚ郯l(fā)育與萌發(fā)對高溫非常敏感［7-8］。番茄作為重要的園藝作物其產(chǎn)量和質(zhì)量卻受到高溫或者低溫的影響。在日溫高于32℃的環(huán)境下生長的番茄植株其雄配子的發(fā)育與功能比雌配子更易受到影響，從而導(dǎo)致授粉受精不良、坐果率下降、果實(shí)品質(zhì)變劣等［9-11］。

關(guān)于番茄高溫脅迫的影響，前人研究重點(diǎn)主要涉及高溫對番茄種子萌發(fā)和植株生長的影響、番茄耐熱性鑒定方法和高溫影響成熟花粉粒表達(dá)譜差異分析等諸多方面［12-14］，但對于持續(xù)高溫脅迫對番茄花粉小孢子發(fā)育影響的細(xì)胞與分子生物學(xué)研究尚未見報(bào)道。正常條件下的番茄小孢子發(fā)育過程的研究表明，絨氈層細(xì)胞在孢母細(xì)胞減數(shù)分裂時(shí)開始出現(xiàn)自溶跡象，而且同一花藥不同藥室內(nèi)，孢母細(xì)胞減數(shù)分裂高度同步［15］。同時(shí)證實(shí)小孢子發(fā)育時(shí)期與花器形態(tài)密切相關(guān)［16-18］。本研究以番茄‘Micro-Tom’為材料，通過 DAPI(4'，6-diamidino-2-phenylindole)染色、石蠟切片等方法對正常情況下小孢子發(fā)育各時(shí)期進(jìn)行劃分;并研究了高溫脅迫對番茄小孢子發(fā)育細(xì)胞學(xué)結(jié)構(gòu)的影響，旨在探索高溫脅迫下小孢子敗育的細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)材料為番茄品種‘Micro-Tom’(Solanum lycopersicum L.)，由美國番茄遺傳資源中心(Tomato Genetics Resource Center，TGRC)本實(shí)驗(yàn)室多代自交保存的穩(wěn)定自交系。在基質(zhì)(草炭∶蛭石∶珍珠巖=3∶1∶1)上培育的幼苗，種植于智能光照培養(yǎng)箱內(nèi)，光照強(qiáng)度約為300 μmol·m-2·s-1，光周期為16 h/8 h(光/暗)，空氣濕度保持在70%—85%。植株正常生長溫周期為(25±1)℃/(20±1)℃(晝/夜)，高溫脅迫處理的溫度為(35±1)℃/(30±1)℃。植株培育現(xiàn)第一花序時(shí)開始高溫脅迫，處理時(shí)間為7 d。對照組植株與熱處理組植株相比，除生長環(huán)境溫周期不同外，保證其他條件均相同。

1.2 方法

1.2.1 DAPI染色法檢測小孢子發(fā)育時(shí)期

進(jìn)行番茄小孢子發(fā)育觀察和時(shí)期劃分的材料種植溫度為(25±1)℃/(20±1)℃。于開花期取處于不同發(fā)育階段的花蕾(圖1)，保持新鮮，用Leica體視顯微鏡拍照并測量花蕾長度。取不同發(fā)育階段的花藥，于潔凈載玻片上用手術(shù)刀橫切花藥并分離出小孢子，用1 mg/mL的DAPI溶液于黑暗環(huán)境下染色小孢子30 s，在Leica DMLB熒光顯微鏡下觀察小孢子發(fā)育各階段的形態(tài)，并用Zeiss CCD系統(tǒng)拍照記錄。

1.2.2 TTC染色法檢測花粉活力

9:00以前取花瓣初展開的番茄花蕾，放入培養(yǎng)皿中，并注意保濕，備用。將50 μL 0.5g/100mL濃度的TTC(Triphenyltetrazolium chloride)溶液滴到潔凈載玻片上，用手術(shù)刀橫切不同發(fā)育階段的花藥，放入載玻片上溶液中擠出花粉粒，加蓋玻片。將制片放入墊有濕吸水紙的培養(yǎng)皿，于37℃恒溫箱中，避光，放置90 min左右，然后取出制片，置于低倍顯微鏡下觀察染色情況并拍照記錄。每份材料觀察不同植株上的3—4個(gè)花蕾，每一花蕾制一個(gè)制片，每片取5個(gè)視野，統(tǒng)計(jì)并計(jì)算花粉的活力百分率。

圖1 番茄‘Micro-Tom’小孢子發(fā)育各時(shí)期花蕾形態(tài)觀察Fig.1 Investigation of bud morphology of Solanum lycopersicum var.Micro-Tom during microspores development stages

1.2.3 花粉體外萌發(fā)法檢測花粉萌發(fā)力

上午9時(shí)以前取花瓣初展開的番茄花蕾，于體外進(jìn)行花粉萌發(fā)實(shí)驗(yàn)?；ǚ勖劝l(fā)液體培養(yǎng)基［19］各成分、工作濃度及培養(yǎng)基pH值分別為:蔗糖120 g/L，H3BO350 mg/L，Ca(NO3)2·4H2O 300 mg/L，MgSO4·7H2O 200 mg/L，KNO3100 mg/L，pH值=6.5。向液體培養(yǎng)基中添加瓊脂粉(終濃度為0.1%)使培養(yǎng)基有適量粘性，防止花粉粒在培養(yǎng)基上漂移到液滴邊緣，保證花粉粒能夠均勻分布。

對照花粉［CK(25℃)，Control Check］分別置于25℃和35℃溫度下萌發(fā)，高溫脅迫處理花粉［HS(35℃)，Heat Stress］也分別置于25℃和35℃溫度下萌發(fā)?；ǚ勖劝l(fā)60 min后在培養(yǎng)基上滴加20 μL 0.1g/100mL濃度的苯胺藍(lán)溶液對花粉管熒光染色3 min，然后在Leica熒光顯微鏡下鏡檢拍照，統(tǒng)計(jì)各處理的花粉萌發(fā)率。

1.2.4 石蠟切片

制作石蠟切片，觀察高溫脅迫前后番茄小孢子發(fā)育各階段的花藥、藥室、絨氈層、小孢子等的變化。分別取對照和高溫脅迫番茄的各級花蕾，固定于FAA固定液(50%乙醇∶冰醋酸∶福爾馬林=18∶1∶1)中48 h，隨后將固定好的材料依次轉(zhuǎn)入50%、70%、85%、95%、100%乙醇中逐級脫水(各1 h)，然后經(jīng)二甲苯徹底透明后，進(jìn)行透蠟和石蠟包埋，包埋好的蠟塊放入4℃冰箱中保存?zhèn)溆?。切片時(shí)制成厚度為8 μm的連續(xù)切片，用鐵礬-蘇木精法染色，中性樹膠干燥封片。Leica DMLB熒光顯微鏡觀察，并用Zeiss CCD系統(tǒng)拍照記錄。

2 結(jié)果與分析

2.1 番茄花粉發(fā)育過程的細(xì)胞學(xué)特征

2.1.1 番茄花粉發(fā)育進(jìn)程

番茄花蕾初期發(fā)育比較慢，從花芽開始分化到可見萼片，以及花瓣的發(fā)生大約需要10 d，到能觀察到初生的雄蕊又需要3 d左右。以后發(fā)育加快，雄蕊發(fā)育到花粉母細(xì)胞可見需要5 d，以后進(jìn)行減數(shù)分裂形成四分體小孢子直到四分體小孢子分離而形成單核花粉粒大約需要4 d，單核花粉粒經(jīng)過約3—4 d就可以形成完全成熟的花粉粒。

2.1.2 小孢子母細(xì)胞形成期至前減數(shù)分裂期

花蕾完全閉合，被萼片包被，呈綠色，有稠密絨毛，花蕾長度約2 mm(圖1 A)。剝離花被，可見各花藥獨(dú)立未形成花藥筒，呈淺黃綠色，透明。石蠟切片觀察，該時(shí)期花藥壁的各層已分化明顯。最外層是表皮，細(xì)胞小，具角質(zhì)層，有保護(hù)功能。表皮下層近于方形的較大細(xì)胞為藥室內(nèi)壁，內(nèi)部1—3層較小的、呈切向延長的扁細(xì)胞，為中層。最內(nèi)一層是絨氈層，為質(zhì)濃、核大的長柱狀細(xì)胞，其功能是提供小孢子發(fā)育所需的營養(yǎng)物質(zhì)。藥室呈馬蹄形，內(nèi)含許多有棱的小孢子母細(xì)胞(圖1 a)。小孢子母細(xì)胞擁有一個(gè)較大的核(圖2 A)，并被具有雙核的絨氈層細(xì)胞所包圍。

圖2 番茄花粉小孢子發(fā)育各時(shí)期的DAPI染色觀察Fig.2 Investigation of tomato microspores development using DAPI staining

2.1.3 前減數(shù)分裂期至四分體時(shí)期

花蕾仍完全閉合，被萼片包被，呈綠色，蕾長2.5—3.5 mm(圖1 B)。各花藥相互靠近結(jié)合但未形成花藥筒，呈淺黃綠色，半透明，藥室內(nèi)空間增大(圖1 b)。小孢子母細(xì)胞完成正常的減數(shù)分裂，分裂完成時(shí)在4個(gè)核間產(chǎn)生細(xì)胞壁，并分隔成由胼胝質(zhì)所包圍的4個(gè)細(xì)胞，形成正四面體形的小孢子四分體，4個(gè)小孢子處于共同的胼胝質(zhì)中，通常只能觀察到3個(gè)小孢子(圖2 B)。

2.1.4 四分體至單核早期

花蕾明顯長大，萼片微高于花冠，花蕾呈淺綠色，蕾長約3.5—4.5 mm(圖1 C)?；ㄋ幓开?dú)立，上部結(jié)合，呈淺黃綠色，藥室內(nèi)空間繼續(xù)增大(圖1 c)。這一階段小孢子已從四分體的胼胝質(zhì)中釋放出來，此時(shí)小孢子具有不規(guī)則形狀(圖2 C)。

2.1.5 單核小孢子中后期

花蕾明顯長大，花冠接近萼片長度，花蕾呈淺綠色、淡黃，蕾長約4.5—6.5 mm(圖1 D)?；ㄋ幓拷Y(jié)合，形成花藥筒，呈黃綠色?；ǚ哿５娜龡l萌發(fā)溝清晰可見，細(xì)胞質(zhì)中含有大液泡，細(xì)胞核靠邊，花粉粒形狀接近圓球形(圖2 D)。

2.1.6 雙核花粉粒形成期

花蕾充分膨大，花萼裂開，呈黃綠色，花冠微露于萼片外，黃色，絨毛稀疏，花蕾長約6.5—7.5 mm。各花藥聯(lián)合形成完整的花藥筒，呈淺黃色(圖1 E，e)?；ǚ哿＝?jīng)過一次有絲分裂后形成雙核花粉粒，此時(shí)期可見一個(gè)染色較淡的營養(yǎng)細(xì)胞和一個(gè)染色較深的生殖細(xì)胞(圖2 E)。

2.1.7 成熟花粉粒時(shí)期

萼片、花瓣全部開裂，暴露出花藥，花冠深黃色，花朵長度約7.5—8.5 mm(圖1 F)?；ㄋ廃S色，花粉囊開裂，能夠散粉(圖1 f)?；ǚ哿０l(fā)育完成，形成顆粒飽滿充實(shí)、細(xì)胞質(zhì)染色較深的成熟花粉粒(圖2 F)。

2.2 高溫脅迫對番茄小孢子發(fā)育影響的分析

2.2.1 花粉TTC染色結(jié)果

在正常溫度環(huán)境 (25℃/20℃)下，花藥內(nèi)的成熟花粉粒數(shù)目多，花粉粒生活力強(qiáng)，花粉紅染率為84.65%。高溫脅迫環(huán)境(35℃/30℃)下，花藥內(nèi)的成熟花粉粒數(shù)目減少，花粉生活力顯著減弱，紅染率為僅為10.72%(圖3)。

圖3 TTC染色法檢測Micro-Tom番茄成熟花粉粒在高溫脅迫前后的生活力變化Fig.3 Analysis of pollen viability of these plants subjected to normal(25℃/20℃)and high(35℃/30℃)temperature treatments by TTC staining

2.2.2 花粉萌發(fā)結(jié)果

對照花粉飽滿、顆粒之間無粘連(圖4 A，B);在25℃和35℃溫度下的萌發(fā)率分別為57.08%和52.62%，35℃下的萌發(fā)率略有降低，但差異不顯著。高溫脅迫花粉有空癟、外壁凹陷、顆粒粘連現(xiàn)象，正?；ǚ哿?shù)目比例較低(圖4 D);無論是在35℃還是在25℃的溫度下，均沒有發(fā)現(xiàn)處理后番茄的花粉管伸長，重復(fù)萌發(fā)實(shí)驗(yàn)并將萌發(fā)時(shí)間延長至4 h仍然未觀察到花粉管伸長(圖4 C)。以上結(jié)果表明35℃/30℃高溫脅迫影響了小孢子發(fā)育，導(dǎo)致花粉敗育，而35℃高溫對正常花粉粒萌發(fā)的影響不顯著。

圖4 適溫與高溫脅迫條件下發(fā)育的番茄‘Micro-Tom’成熟花粉粒體外萌發(fā)比較Fig.4 In vitro germination of tomato pollen grains under optimum(CK，25℃/20℃)or high temperature(HS，35℃/30℃)

2.2.3 石蠟切片結(jié)果

高溫脅迫處理材料與對照材料均能夠正常分化花藥壁的各層，藥室內(nèi)的花粉小孢子母細(xì)胞排列整齊(圖5 A，G)。小孢子發(fā)育在四分體時(shí)期開始表現(xiàn)出差異。與對照相比，高溫脅迫處理材料的絨氈層細(xì)胞異常肥厚(圖5 H)。到了單核小孢子時(shí)期，對照材料的小孢子從胼胝質(zhì)中釋放出來，形狀逐漸變圓，小孢子大小一致，細(xì)胞核接近小孢子中央，絨氈層開始降解并且貼近藥室內(nèi)壁(圖5 C);此時(shí)期，高溫脅迫處理材料中只有一部分小孢子從四分體中釋放出來，大部分畸形并且聚集成團(tuán)，絨氈層沒有降解反而明顯膨大、擠壓進(jìn)入藥室內(nèi)部(圖5 I)。單核小孢子中后期，對照材料的小孢子相互獨(dú)立分散于藥室內(nèi)、染色加深，絨氈層降解留下絲線狀殘骸，藥室內(nèi)壁細(xì)胞降解消退，花藥表皮細(xì)胞呈細(xì)長狀縱向排列，藥隔細(xì)胞減少，花藥同側(cè)兩藥室間膈膜變薄，裂口處的環(huán)狀細(xì)胞簇形成正常的圓環(huán)為花藥開裂做準(zhǔn)備(圖5 D);高溫脅迫處理材料中，畸形小孢子則較多、大小不一致，絨氈層細(xì)胞體積增大、具有大液泡和較大細(xì)胞核，部分絨氈層細(xì)胞相互擠壓而破裂，花藥表皮細(xì)胞呈方形，裂口處的環(huán)狀細(xì)胞簇形成的圓環(huán)形狀不規(guī)則(圖5 J)。雙核花粉粒時(shí)期(開花前一天)，對照花粉粒充實(shí)，細(xì)胞質(zhì)染色較深，僅有個(gè)別花粉?；?，絨氈層完全消失或僅存殘余，花藥同側(cè)的兩個(gè)藥室之間的藥隔解體，兩個(gè)藥室相互連通成為一體，裂口附近花藥壁僅剩一層表皮細(xì)胞且排列整齊，花藥開裂(圖5 E);高溫脅迫處理材料花藥中的正常花粉粒極少，多數(shù)花粉?；位蛲Ｖ拱l(fā)育，而且花粉粒被絨氈層細(xì)胞包圍而積聚粘連，花藥開裂但裂口不規(guī)則，裂口附近花藥壁細(xì)胞畸形(圖5 K)?；ǘ溟_放時(shí)，對照材料藥室完全打開，都能散粉，花藥維管等組織仍保持原有結(jié)構(gòu)(圖5 F);然而，高溫脅迫材料的藥室塌陷，花藥表現(xiàn)出萎縮狀(圖5 L)。

對番茄小孢子發(fā)育過程的連續(xù)觀察研究，表明35℃熱脅迫處理影響了小孢子、絨氈層、藥隔、花藥壁等的正常發(fā)育，從而導(dǎo)致花粉?；位驍∮?，產(chǎn)生的正?；ǚ哿?shù)量嚴(yán)重減少，花藥散粉障礙等，進(jìn)而影響花朵的正常授粉受精過程。

3 討論

番茄品種‘Micro-Tom’由于其生長周期短，易于栽培等特性，已經(jīng)成為番茄遺傳與發(fā)育研究的重要模式品種。本研究通過對番茄‘Micro-Tom’小孢子細(xì)胞核形態(tài)學(xué)以及DAPI染色觀察，依據(jù)核發(fā)育變化，將小孢子發(fā)育過程分為孢母細(xì)胞時(shí)期、四分體小孢子時(shí)期、單核小孢子早期、單核小孢子中后期、雙核花粉粒時(shí)期和成熟花粉粒時(shí)期等6個(gè)主要時(shí)期，這與Brukhin［16］、辛建華［17］等對番茄小孢子發(fā)育主要時(shí)期的劃分基本一致。依據(jù)番茄‘Micro-Tom’小孢子發(fā)育時(shí)期與花蕾外部形態(tài)、花蕾長度和花藥發(fā)育特征的對應(yīng)關(guān)系，劃分出的小孢子發(fā)育時(shí)期依次對應(yīng)于 Brukhin［16］劃分的花發(fā)育階段的 stage7-8、stage9-11、stage12-13、stage14-15、stage16-17 和stage18-20。因此，依據(jù)花蕾形態(tài)觀察能夠判斷‘Micro-Tom’番茄小孢子發(fā)育時(shí)期，為后續(xù)番茄生殖發(fā)育分子生物學(xué)研究提供取材依據(jù)。但由于花蕾的大小會(huì)因環(huán)境的變化而存在差異［17］，實(shí)驗(yàn)中應(yīng)注意環(huán)境條件的控制，在精細(xì)實(shí)驗(yàn)中有必要借助于小孢子的鏡檢觀察來準(zhǔn)確無誤地確定發(fā)育時(shí)期。

圖5 番茄‘Micro-Tom’各級花蕾的石蠟切片觀察Fig.5 Investigation of tomato microspores development stages using paraffin section

可育番茄小孢子在正常發(fā)育情況下，絨氈層在單核小孢子發(fā)育早期啟動(dòng)PCD(Programmed Cell Death)進(jìn)程，不斷自我降解而提供營養(yǎng)給小孢子發(fā)育。本研究發(fā)現(xiàn)，高溫脅迫(35℃/30℃)后，花藥絨氈層內(nèi)絨氈層細(xì)胞液泡化膨大、裂口附近細(xì)胞延遲降解，而番茄小孢子畸形或敗育、空癟凹陷花粉粒數(shù)量比例大等現(xiàn)象。絨氈層發(fā)育異?，F(xiàn)象在番茄雄性不育材料中的研究較多。本研究表明，熱脅迫處理番茄的小孢子敗育從四分體小孢子時(shí)期到花粉成熟時(shí)期均有發(fā)育異常表現(xiàn)，這一結(jié)果與毛秀杰［20］、袁亦楠［21］等研究的番茄雄性不育系小孢子發(fā)育異常發(fā)生在廣泛時(shí)期內(nèi)的結(jié)果基本一致。本研究結(jié)果表明，熱脅迫處理造成花粉畸形或敗育與絨氈層細(xì)胞的發(fā)育紊亂密切相關(guān)。絨氈層細(xì)胞降解延遲，未提供充足的營養(yǎng)物質(zhì)供小孢子發(fā)育和花粉壁結(jié)構(gòu)的形成，類似現(xiàn)象在水稻［22］、擬南芥［23-24］等作物研究中也有報(bào)道。同時(shí)，絨氈層細(xì)胞高度液泡化并向藥室內(nèi)生長使藥室內(nèi)空間變小;花朵開放花藥開裂時(shí)，破碎的絨氈層細(xì)胞及其內(nèi)含物使花粉粒粘連成團(tuán)，該現(xiàn)象在本研究花粉萌發(fā)實(shí)驗(yàn)中同樣可被觀察到，表明高溫脅迫不僅使花粉畸形或敗育，而且使花藥散粉困難。

本研究還發(fā)現(xiàn)，熱脅迫還引起了藥隔組織、藥室內(nèi)壁、花藥表皮、環(huán)狀細(xì)胞簇等花藥細(xì)胞結(jié)構(gòu)的發(fā)育異常。張桂蓮等［25］對水稻的研究發(fā)現(xiàn)，水稻耐熱品系在高溫脅迫下花藥維管組織正常，而熱敏感品系在高溫脅迫下花藥維管組織發(fā)育異常。高溫脅迫使番茄植株韌皮部形成胼胝質(zhì)，胼胝質(zhì)因阻塞胞間連絲而增加韌皮部的阻力［11］，而高溫對番茄花藥維管組織發(fā)育是否有類似影響尚需研究考證。有關(guān)熱脅迫引起的番茄小孢子和花藥組織發(fā)育異常的分子生物學(xué)研究在本實(shí)驗(yàn)室還在進(jìn)行中，希望有助于闡明熱脅迫對番茄小孢子發(fā)育的影響機(jī)制，并為培育耐高溫農(nóng)作物新品種提供新途徑。

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