張延輝，李江華，孫 強(qiáng)，帕提古麗，阿不來(lái)提

（1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué) 草業(yè)與環(huán)境科學(xué)學(xué)院/新疆草地資源與生態(tài)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆 烏魯木齊 830052；2.新疆維吾爾自治區(qū)烏魯木齊市公安局，新疆 烏魯木齊 830052；3.新疆維吾爾自治區(qū)草原總站，新疆 烏魯木齊 830052）

狗牙根（Cynodon dactylon）是暖地型草坪草中最重要的草種之一，且在世界各地廣泛種植，狗牙根屬共有9個(gè)種10個(gè)變種［1］。我國(guó)華南、華中、西南、西北、華北南部均有狗牙根分布［2］。不同地域的狗牙根即使在同一種內(nèi)仍然存在著及其豐富的遺傳變異。評(píng)價(jià)一種種質(zhì)資源的遺傳多樣性，對(duì)深入了解該資源的種群結(jié)構(gòu)、變異程度、居群豐富度，開(kāi)展核心種質(zhì)庫(kù)的構(gòu)建及優(yōu)良性狀的選育工作具有重要的意義。新疆南北疆各地均有狗牙根分布，這些野生狗牙根的不同居群在形態(tài)、地域環(huán)境上差別很大，表現(xiàn)為不同的生態(tài)型，阿不來(lái)提將分布于南北疆平原綠洲不同生態(tài)條件下的狗牙根分為伊犁型（北疆型）和喀什型（南疆型）兩大類［3］。目前，新疆狗牙根的研究工作涉及各方面，包括形態(tài)、抗性、生理［4，5］等，但分子水平方面的研究剛剛起步，筆者僅就部分野生材料進(jìn)行了SRAP標(biāo)記研究，而較全面的評(píng)價(jià)新疆地區(qū)的狗牙根材料，亟需在建立較完整種質(zhì)資源圃的情況下利用分子標(biāo)記技術(shù)探究其遺傳變異，從DNA水平評(píng)價(jià)其遺傳多樣性。

相關(guān)序列擴(kuò)增多態(tài)性（SRAP）標(biāo)記方法具有簡(jiǎn)便、中等產(chǎn)量、高共顯性、易于分離條帶及測(cè)序，不需預(yù)知物種的序列信息等優(yōu)點(diǎn)［6］。相比于SSR標(biāo)記，其引物開(kāi)發(fā)的成本大大降低，而且該技術(shù)主要針對(duì)ORF開(kāi)放閱讀框設(shè)計(jì)引物，對(duì)內(nèi)含子、外顯子及啟動(dòng)子區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)增，比較穩(wěn)定。目前，在草坪草的選育上，運(yùn)用該技術(shù)開(kāi)展多樣性研究還較少。Budak等［7］利用34對(duì)SRAP引物組合分析了53份野牛草種質(zhì)的遺傳多樣性及其與表型的關(guān)系。易楊杰等［8］對(duì)四川、重慶、貴州、西藏4省區(qū)的野生狗牙根材料進(jìn)行了遺傳多樣性分析。

利用SRAP標(biāo)記技術(shù)對(duì)106份狗牙根材料進(jìn)行遺傳多樣性研究，旨在揭示不同野生狗牙根材料間的親緣關(guān)系，遺傳背景、變異程度及遺傳多樣性水平，為選育優(yōu)良的狗牙根新品種提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 供試材料

供試的狗牙根材料共106份，部分采自新疆不同地區(qū)，部分引自國(guó)內(nèi)外其他地區(qū)，狗牙根材料編號(hào)及來(lái)源見(jiàn)表1。2008年5月將供試的狗牙根材料種植于新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)試驗(yàn)場(chǎng)原始資源圃，小區(qū)面積1.0m×2.5 m，小區(qū)間距70cm，期間進(jìn)行灌溉、雜草防除等田間管理工作。

表1 106份野生狗牙根的采集地點(diǎn)Table 1 The collection areas of 106bermudagrass accessions

續(xù)表1

1.2 試驗(yàn)方法

采用CTAB法［12］提取樣品總 DNA，從238對(duì)SRAP引物組合篩選出14對(duì)多態(tài)性較好的組合用于PCR擴(kuò)增，采用10μL反應(yīng)體系，反應(yīng)液含1.4μL 10×Buffer，0.25mmol/L dNTP，1μmol/L引物，0.2U的Taq DNA聚合酶及15ng模板DNA。SRAP－PCR擴(kuò)增在PTC2200（MJ，USA）PCR儀上完成。

擴(kuò)增程序：94℃預(yù)變性5min；94℃變性1min，35℃復(fù)性1min，72℃延伸1min，循環(huán)5次；94℃變性1min，50℃復(fù)性1min，72℃延伸1min，循環(huán)35次；72℃延伸10min，4℃保存。擴(kuò)增產(chǎn)物加3μL上樣緩沖液，用6%非變性PAGE電泳檢測(cè)，上樣量3 μL，3μL 100bpLadderMarker。電壓200V，電泳約60min，采用銀染，數(shù)碼相機(jī)照相記錄結(jié)果。同時(shí)設(shè)置不含DNA樣本的陰性對(duì)照（用ddH2O代替DNA），以確定每次PCR實(shí)驗(yàn)時(shí)材料的DNA是否存在自擴(kuò)增或污染。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

根據(jù)擴(kuò)增產(chǎn)物的條帶有或無(wú)分別賦值，有帶的記為1，無(wú)帶的記為0，獲得二元數(shù)據(jù)矩陣。利用NTSYS－pc2.1統(tǒng)計(jì)分析軟件計(jì)算不同材料間的遺傳相似系數(shù)（GS）。根據(jù)GS值按非加權(quán)平均距離（UPGMA）進(jìn)行遺傳相似性聚類分析，利用POPGENE軟件進(jìn)行各項(xiàng)遺傳參數(shù)的統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 引物篩選結(jié)果及擴(kuò)增效果的比較

通過(guò)對(duì)14對(duì)正向引物，17對(duì)反向引物進(jìn)行兩兩組合，共形成238對(duì)引物組合。通過(guò)對(duì)該引物組合進(jìn)行篩選，共獲得14對(duì)多態(tài)性較高、條帶清晰、穩(wěn)定性和重復(fù)性好的引物組合（表2），運(yùn)用該引物組合分別對(duì)106份材料的基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增。結(jié)果表明，14個(gè)引物組合共產(chǎn)生133條帶，平均每個(gè)引物產(chǎn)生9.5條，其中有123條顯示多態(tài)性，多態(tài)性百分率為92.5%，Nei’s基因多樣性指數(shù)（H）變異為0.244 2～0.499 8，平均為0.414 5（表3）。其中，引物組合Me21－Em13擴(kuò)增的總位點(diǎn)最多，有12個(gè)，引物組合Me17－Em12和Me22－Em18多態(tài)性位點(diǎn)最少，僅有7個(gè)。供試的樣品具有不同的SRAP帶型，擴(kuò)增片段在100bp～1 500bp，多態(tài)性檢出率較高。表明SRAP能檢測(cè)的遺傳位點(diǎn)比較豐富，初步表明新疆野生狗牙根在DNA分子水平遺傳多樣性很豐富。

表2 14對(duì)SRAP引物序列及其擴(kuò)增結(jié)果Table 2 Sequences of 14SRAP primers and amplification results

表3 研究所用SRAP引物組合的擴(kuò)增結(jié)果及多態(tài)性信息Table 3 Results and the polymorphism information of SRAP primer combinations used in the present study

2.2 遺傳多樣性分析

對(duì)SRAP－PCR擴(kuò)增結(jié)果采用 Nei－Li相似系數(shù)（GS）的計(jì)算方法，得到相似性矩陣。供試材料之間差異明顯，具有較為豐富的遺傳多樣性（表4），有效等位基因數(shù)（Ne）在1.236 3～1.593 8，Nei′s基因多樣性指數(shù)（H）在0.159 0～0.347 4，Shannon信息指數(shù)（I）在0.254 0～0.516 7，表明新疆野生狗牙根材料種內(nèi)存在廣泛的變異，其中以材料cd01多樣性最為豐富，Nei′s基因多樣性（H）為0.347 4，Shannon信息指數(shù)（I）為0.516 7。

表4 SRAP標(biāo)記分析狗牙根的遺傳多樣性Table 4 Genetic diversity of native bermuda grass by SRAP mark

續(xù)表4

續(xù)表4

2.3 聚類分析

根據(jù)14對(duì)引物組合的PCR擴(kuò)增結(jié)果，基于遺傳相似系數(shù)，利用UPGMA法繪制出供試材料SRAP標(biāo)記遺傳多樣性分子聚類圖（圖1）。從聚類圖上可以看出，106份供試材料在L＝0.51時(shí)，可以分成3個(gè)組：在第1大組中，共計(jì)90份材料，被分成了3個(gè)亞類。其中，來(lái)自伊犁的一種材料和采自華南的材料單獨(dú)聚為一類（cd001和cd128），而且距離其他材料較遠(yuǎn)。聚類結(jié)果顯示，不同來(lái)源地的材料也有聚在一起，如cd16、cd20；也有部分來(lái)源地相同的材料聚在不同的亞類中，如cd15、cd114、與cd117，說(shuō)明來(lái)源地相同的材料有可能是同一種材料，其遺傳相似度極高，但不同來(lái)源的材料也聚在一大組中，說(shuō)明這些材料有一定程度的變異。在第2組中，共計(jì)15份材料，cd37自為一類，而cd32、cd49、cd50聚在一起，遺傳基礎(chǔ)較為相似，這些材料普遍來(lái)自氣候較熱的地區(qū)，比如哈密、吐魯番，說(shuō)明具有較一致的生態(tài)型的材料容易聚到一起。在第3組中cd129自成一類，同其他材料遺傳距離較大，親緣關(guān)系比較遠(yuǎn)。從聚類結(jié)果也可以看出，SRAP標(biāo)記對(duì)材料的區(qū)分能力及鑒別的準(zhǔn)確性比較好。

圖1 106份狗牙根材料UPGMA聚類圖Fig.1 Dendrogram of 106genotypes from the UPGMA cluster analysis

3 討論與結(jié)論

3.1 新疆狗牙根的多態(tài)性

利用SRAP標(biāo)記技術(shù)分析了106份狗牙根材料的遺傳多樣性，從238個(gè)引物組合中篩選出多態(tài)性高的14個(gè)引物組合，共擴(kuò)增出123條多態(tài)性條帶，定位了523個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)，其中多態(tài)性條帶比例為92.5%，表明新疆野生狗牙根資源具有較高的遺傳多樣性。已有的一些研究結(jié)果在多態(tài)性統(tǒng)計(jì)上有一些差異。凌瑤測(cè)定的中國(guó)西南5省區(qū)的44份野生狗牙根及8份非洲狗牙根材料的多態(tài)性位點(diǎn)為87.29%［9］；易楊杰對(duì)野生狗牙根種質(zhì)研究，多態(tài)性條帶比例為79.8%［8］。周少云等［10］應(yīng)用ISSR標(biāo)記對(duì)廣東地區(qū)30份野生狗牙根進(jìn)行遺傳多樣性研究，多態(tài)性條帶比率達(dá)93.7%。這些研究結(jié)果的差異主要與不同地域野生狗牙根材料本身具豐富的遺傳變異，以及材料樣本選取量大小有關(guān)。

3.2 狗牙根的遺傳相似性

根據(jù)此次試驗(yàn)的結(jié)果，106份狗牙根的遺傳相似性GS值在0.36～0.94，平均為0.65。齊曉芳等［11］利用AFLP標(biāo)記對(duì)采自非洲以及中國(guó)四川、重慶、云南、貴州和西藏5省區(qū)的共44份野生狗牙根材料進(jìn)行遺傳多樣性分析，遺傳相似系數(shù)（GS）為0.64～0.95，平均GS值為0.76。新疆野生狗牙根部分材料間的相似系數(shù)較低，遺傳距離很遠(yuǎn)，表明狗牙根種內(nèi)具有大量可供遺傳變異選擇的基因型，這為選育優(yōu)良品種提供了良好的基礎(chǔ)。

3.3 新疆狗牙根遺傳變異與地理來(lái)源的相關(guān)性分析

物種的遺傳變異和地理生態(tài)環(huán)境之間的關(guān)系一直是植物種群遺傳學(xué)普遍關(guān)注的問(wèn)題，目前，多數(shù)研究認(rèn)為物種的基因與種質(zhì)的地理分布間存在有一定的相關(guān)性［12］。劉偉等［13］將西南區(qū)42份野生狗牙根材料的遺傳距離矩陣和與之對(duì)應(yīng)的地理距離矩陣進(jìn)行相關(guān)分析，結(jié)果表明大部分野生狗牙根材料的遺傳距離與地理來(lái)源之間無(wú)嚴(yán)格的一致性關(guān)系。筆者所得結(jié)論認(rèn)為材料與地理之間有一定的相關(guān)性，聚類結(jié)果可以在一定程度上反映與地理距離之間的聯(lián)系。聚類結(jié)果比較發(fā)現(xiàn)，在大的類群劃分上表現(xiàn)出一定的一致性，但在類群內(nèi)表現(xiàn)出較大的差異。生境相近的大部分品種，在SRAP分子標(biāo)記上也能聚在一起，而且在地理位置上越接近的品種，在二者的一致性上表現(xiàn)得越顯著，相同或相鄰生境較易聚在一起的。如吐魯番、托克遜、哈密等地的材料。在所有的材料中，以來(lái)自伊犁的材料遺傳多樣性最豐富，分布在兩個(gè)大組中，這可能與伊犁地區(qū)地域特點(diǎn)有關(guān)。因此，在做聚類分析時(shí)應(yīng)結(jié)合形態(tài)、生理生化數(shù)據(jù)及地理特征進(jìn)一步分析。

［1］ Boune J M.Morocco’s native perennial turf grasses are a treasure trove of diversity and they’re disappearing［J］.Diversity，2000，16：53－54.

［2］ 劉建秀，賀善安.暖季型草坪草種質(zhì)資源的研究與改良［J］.國(guó)外畜牧學(xué)－草原與牧草，1996（3）：12－30.

［3］ 阿不來(lái)提，石定燧，楊光，等.新疆野生狗牙根研究初報(bào)［J］.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，1998（2）：124－127.

［4］ 孫宗玖，阿不來(lái)提，齊曼，等.狗牙根新品種抗寒性評(píng)價(jià)及生理基礎(chǔ)研究［J］.中國(guó)草地，2003（4）：25－30.

［5］ 孫宗玖，阿不來(lái)提，齊曼，等.冷害脅迫下3個(gè)狗牙根品種抗寒性比較研究［J］.草業(yè)科學(xué)，2004（1）：39－42.

［6］ Ferriol M，Pico B，Nuez F.Genetic diversity of a germplasm collection of Cucurbita pepo using SRAP and AFLP markers［J］.Theoretical and Applied Genetics，2003，107：271－282.

［7］ Budak H，Shearman R C，Parmaksiz I，et al.Molecular characterization of Buffalo grass germplasm using sequence－related amplified polymorphism markers［J］.Theor Appl Genet，2004，108：325－361.

［8］ 易楊杰，張新全，黃琳凱，等.野生狗牙根種質(zhì)遺傳多樣性的SRAP研究［J］.遺傳，2008，30（1）：94－100.

［9］ 凌瑤，張新全，齊曉芳，等.西南五省區(qū)及非洲野生狗牙根種質(zhì)基于SRAP標(biāo)記的遺傳多樣性分析［J］.草業(yè)學(xué)報(bào)，2010，19（2）：196－203.

［10］ 周少云，黃春瓊，劉國(guó)道.廣東地區(qū)野生狗牙根遺傳多樣性的ISSR分析［J］.熱帶作物學(xué)報(bào)，2010，31（5）：797－802.

［11］ 齊曉芳，張新全，凌瑤，等.野生狗牙根種質(zhì)資源的AFLP遺傳多樣性分析［J］.草業(yè)學(xué)報(bào)，2010，19（3）：155－161.

［12］ Wilson B L，Kitzmiller J，Rolle W，et al.Isozyme variation and its environmental correlates in Elymusglaucusfrom the California Floristic Province［J］.Canadian Journal of Botany，2001，79：139－153.

［13］ 劉偉，張新全，李芳，等.西南區(qū)野生狗牙根遺傳多樣性的ISSR標(biāo)記與地理來(lái)源分析［J］.草業(yè)學(xué)報(bào)，2007，16（3）：55－61.