趙騰達　左金華　王麗芳等

[摘要] 目的 研究大鼠腮腺主導管結扎后萎縮腮腺內肌上皮細胞（MEC）的轉歸規(guī)律。方法 通過結扎大鼠右側腮腺主導管誘導腺體萎縮，采用蘇木精-伊紅（HE）染色觀察正常腮腺及導管結扎后1、3、5、7、14、21、30、60、100、150 d萎縮性腮腺的組織學變化，并采用免疫組織化學染色方法定量分析MEC在腮腺萎縮不同時間點的數(shù)量及分布情況。結果 組織學觀察發(fā)現(xiàn)：腮腺主導管結扎5 d后，大部分腺泡細胞出現(xiàn)凋亡喪失，在腺體萎縮過程中形成大量導管樣結構，間質逐漸纖維化并伴有炎性細胞浸潤。免疫組織化學染色定量分析結果顯示：導管結扎后5 d內，MEC數(shù)量快速增加，隨后其數(shù)量增長緩慢，維持在一定的范圍內，100 d時MEC數(shù)量達到峰值，其后快速減少；在腮腺萎縮早期，MEC位于腺泡及閏管表面，呈星形或梭形，隨著腺體的萎縮，最終呈梭形分布于導管樣結構的外層。結論 在導管結扎后5 d內，MEC出現(xiàn)反應性大量增殖，隨后數(shù)量增長緩慢，維持在一定的范圍內；隨著腮腺的逐漸萎縮，100 d后MEC數(shù)量快速減少。

[關鍵詞] 肌上皮細胞； 腮腺； 萎縮； 導管結扎

[中圖分類號] R 780.2 [文獻標志碼] A [doi] 10.7518/hxkq.2013.01.007 由于受到頭頸部腫瘤放射治療、舍格倫綜合征及唾液腺炎等因素的影響，人體大唾液腺會出現(xiàn)腺體萎縮和唾液分泌功能下降等現(xiàn)象，給患者的生理、心理帶來嚴重的影響，但目前尚無有效的治療手段。如何治療唾液腺萎縮和促進腺體功能恢復已經日益引起人們的重視。在唾液腺組織成分中，肌上皮細胞（myoepithelial cell，MEC）被普遍認為是可能導致唾液腺腫瘤（包括多形性腺瘤、肌上皮瘤等）發(fā)生的潛能祖細胞之一[1]，其內含肌動蛋白，能夠接受交感

及副交感神經α1-腎上腺素受體及毒蕈堿受體的協(xié)同誘導作用而發(fā)生收縮，促進腺泡及導管的分泌[2]，抑

制唾液腺的萎縮。目前對長期萎縮性腮腺內MEC病理變化的研究仍然較少。本實驗通過結扎大鼠腮腺主導管[1，3]誘導腺體發(fā)生漸進性萎縮，并應用免疫組織化學方法定量測定MEC在萎縮性腮腺不同時間點的數(shù)量及分布，結合腺體的組織學變化，觀察MEC在腮腺萎縮過程中的轉歸規(guī)律。

1 材料和方法

1.1 實驗對象

成年健康的雄性SD大鼠66只，體重（300±20） g，購于山東綠葉制藥有限公司。66只大鼠隨機分為11組，每組6只，常規(guī)飼養(yǎng)。

1.2 實驗方法

用質量分數(shù)3%水合氯醛行腹腔內注射麻醉，劑量為10 mL·kg-1。麻醉后將大鼠右側腮腺嚼肌區(qū)備皮后置于無菌操作臺上，消毒，于右耳前下方作長約1 cm的縱形小切口，暴露眶外淚腺；在眶外淚腺下極的中部分離出咬肌表面的腮腺主導管及伴行神經，用3—0絲線結扎腮腺主導管，縫合皮膚。術后常規(guī)飼養(yǎng)，分別將各組大鼠于導管結扎后第0（正常對照

組）、1、3、5、7、14、21、30、60、100、150天處死，切取右側腮腺，放入質量分數(shù)4%的多聚甲醛固定液中固定。

1.3 組織學觀察

各組動物的腮腺組織樣本固定24 h后，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，然后浸蠟、包埋，制成4 μm厚切片，行蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色，置于光鏡下觀察腮腺的組織學變化。

1.4 免疫組織化學觀察

采用特異性α平滑肌肌動蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）單克隆抗體（武漢博士德生物工程有限公司）對腮腺標本進行免疫組織化學染色，染色采

用SABC法，抗體稀釋度為1∶250，DAB顯色，蘇木精輕度復染，觀察MEC的表達情況。

1.5 MEC計數(shù)及統(tǒng)計分析

將免疫組織化學切片放置于Olympus BX51型（Olympus公司，日本）顯微鏡的高倍鏡下觀察。每張切片隨機選擇5個視野拍照，采用ImagePro Plus 6.0圖像軟件計數(shù)MEC的數(shù)目。實驗數(shù)據(jù)采用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件進行分析，各組均數(shù)的比較采用單因素方差分析，檢驗水準為雙側α=0.05。

2 結果

2.1 大體觀察結果

導管結扎1 d時，大鼠右側腮腺的體積較正常對照組明顯增大，腺小葉水腫、分界不清；3 d時，腺體體積恢復正常；7 d時，腺體體積明顯減小。隨著導管結扎時間的延長，腺體組織逐漸縮小，色澤加深呈灰色，質地變韌；小葉間隔增厚，并可分離縮小的腺小葉。結扎100 d時，腺體縮小明顯，體積約為正常腺體的一半；150 d時，腺體組織內完全看不到腺小葉結構。

2.2 組織學觀察結果

正常對照組：腮腺組織正常；覆蓋在腺體表面的纖維結締組織被膜深入腺實質，將腺體分成許多腺葉和腺小葉，腺實質內見有漿液性腺泡及導管系統(tǒng)（閏管、紋管及排泄管），腺泡細胞大小均勻，排列規(guī)則（圖1A）。結扎1 d組，腮腺內除可見部分導管擴張以外，腺實質與正常對照組基本相似。3 d組，腺小葉的排列開始出現(xiàn)紊亂現(xiàn)象，腺泡細胞未見消失。5、7 d組，腮腺的腺體組織出現(xiàn)較明顯的變化：大部分腺泡細胞消失，殘余腺泡局限于腺小葉周邊，導管樣結構明顯；小葉間隔增厚，內有單核細胞浸潤（圖1B）。14 d組，腺體內腺泡萎縮嚴重，導管樣

結構數(shù)目明顯增加，單核細胞（主要為巨噬細胞）浸潤在殘余導管樣結構內，小葉間隔纖維化并有大量淋巴細胞浸潤。21 d組，導管樣結構幾乎組成了整個腺實質，在腺實質結構內存在淋巴細胞浸潤。30 d組，腮腺內基本只包括擴張的導管樣結構，由纖維結締組織包繞，小葉間隔呈致密纖維化，并包含部分淋巴細胞及少數(shù)排泄管。60 d組，腺體內導管樣結構的數(shù)目減少，出現(xiàn)不規(guī)則擴張（圖1C）。100 d組，

導管樣結構異形更加明顯，管腔繼續(xù)呈圓形擴張。150 d組，導管樣結構及異形導管數(shù)量減少，腺實質廣泛纖維化并逐漸代替腺體組織，已無明顯淋巴細胞浸潤（圖1D）。

2.3 免疫組織化學染色結果

經免疫組織化學染色觀察MEC的分布及形態(tài)變化見圖2、3。在正常對照組及1 d組，腺泡及閏管邊緣可觀察到少量陽性表達的MEC（圖2A）；3 d組的

MEC在腺泡表面呈星形，而在閏管處則呈梭形（圖

3A）；5 d及7 d組可觀察到MEC數(shù)目明顯增加，其形態(tài)變化由梭形至星形不等，主要位于導管樣結構周圍（圖2B）。隨著腺體的萎縮，腺泡細胞的完全喪失及大量導管樣結構的出現(xiàn)，21、30 d組可觀察到腺實質內的大導管幾乎全部被梭形的MEC所包繞，導管樣結構呈典型的雙套層結構，大量陽性表達的MEC主要位于外層；60、100 d組導管樣結構的管腔繼續(xù)呈圓形擴張，數(shù)量減少，MEC陽性表達的表現(xiàn)類似于30 d組（圖2C）；150 d組的導管樣結構管腔變小，

MEC呈梭形包繞在導管樣結構的外層（圖3B），MEC數(shù)量較前幾組明顯減少（圖2D）。

A：腮腺萎縮早期（3 d組），MEC在腺泡表面呈星形（空箭頭），在閏管處呈梭形（黑箭頭）；B：腮腺萎縮晚期（150 d組），MEC呈梭形（黑箭頭），包繞在導管樣結構的外層。

Fig 3 Morphology of MEC during the early and late phase of

glandular atrophy oil immersion lens × 1 000

2.4 MEC計數(shù)結果

腮腺導管結扎后不同時間點的MEC計數(shù)結果見表1。由表1可見：導管結扎后MEC數(shù)量顯著增加，尤以5 d組增加最快，100 d達到最大值之后數(shù)量又迅速減少。經單因素方差分析，各時間點的MEC數(shù)符合正態(tài)分布及方差齊性（P=0.069），采用LSD法進行多重比較，結果發(fā)現(xiàn)：正常對照組MEC數(shù)除與1、150 d組無明顯差異外，與其他各組的差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；3 d組與150 d組的差異無統(tǒng)計學意義

（P>0.05），與其他各組的差異均有統(tǒng)計學意義（P<

0.05）；自結扎第5天起，5 d組與隨后的7、14、21、30、60 d組的差異均無統(tǒng)計學意義（P>0.05）；而100 d

組除與14、21、30、60 d組的差異無統(tǒng)計學意義外（P>0.05），與其他各組的差異均有統(tǒng)計學意義（P<

0.05）。

3 討論

腺體萎縮是唾液腺疾病中最常見的病理變化，其萎縮過程較復雜。早期唾液腺萎縮可引起分泌功能減退，導致唾液流量減少。這一現(xiàn)象有學者[4]認為是

由炎癥反應引起的，但Correia等[5]則認為非炎性機制（如腺泡萎縮）可能是主要原因。目前關于導管結扎后快速誘導腺體萎縮的具體機制仍不清楚。Takahashi

等[6]發(fā)現(xiàn)：Fas/FasL通過激活Caspase-8和Caspase-3，可以在誘導唾液腺細胞凋亡中發(fā)揮重要作用。通過結扎腮腺主導管誘導腺體萎縮，可觀察到如下典型變化：腺泡細胞的凋亡喪失，大量導管樣結構的出現(xiàn)，腺實質逐漸纖維化并炎性細胞的浸潤，以及MEC的數(shù)量、位置及形態(tài)的改變。在萎縮過程中MEC在一定程度上能夠抑制腺體的萎縮[3]。Walker等[7]發(fā)現(xiàn)：在正常唾液腺內很少觀察到MEC，但隨著腺體的漸進性萎縮，MEC陽性表達明顯，并最終完全圍繞在導管樣結構周圍；而Takahashi等[8]證實MEC在腺體

萎縮晚期的存活通過表達Bcl-2來維持。此外，MEC在繼發(fā)性舍格倫綜合征患者唾液腺炎癥病變過程中亦可能作為靶細胞，被淋巴細胞浸潤破壞后最終導致腺泡和導管上皮的喪失[9]。還有研究[10-11]發(fā)現(xiàn)：MEC的形態(tài)差異可能與唾液腺病理萎縮狀態(tài)有一定的相關性，在萎縮唾液腺的腺泡表面包繞著典型的星狀MEC可作為腺體功能恢復的早期征象。

本研究觀察到，腮腺導管結扎1 d后，MEC平均數(shù)（641.00）較正常對照組（566.50）稍有增多，3 d組（945.50）明顯增多，5 d組（1 430.25）的數(shù)量甚至達到正常對照組的2.5倍，這表明MEC在導管結扎后大量快速增殖，尤以導管結扎5 d時增加最多。導管結扎后5～30 d內，MEC數(shù)量雖有增加，但都維持在一定的范圍內。該結果與Burgess等[1]觀察到的MEC增殖

活性的結論相一致。腮腺導管結扎1周后，MEC環(huán)繞在部分殘余導管表面，并發(fā)生形態(tài)變化，呈梭形至星形不等。筆者認為，MEC自身增殖以及對導管阻塞的抵抗效應是引起其數(shù)量增多的重要因素。

在腮腺萎縮過程中，腺泡細胞消失及導管樣結構的出現(xiàn)導致腺體組織變化較大，因此MEC在腺體中的數(shù)量不僅與腺泡數(shù)量的多少有關，還與其本身的分布有關。本實驗發(fā)現(xiàn)7 d組的MEC數(shù)量較5 d組略微減少，這可根據(jù)Burgess等[3]的觀點進行解釋：MEC

在萎縮過程中的變化主要與相鄰的閏管有關，閏管在該期的增多導致單位視野內MEC相對減少，而腺泡細胞在該時間點的持續(xù)喪失亦可能是導致MEC數(shù)目減少的另一因素。至于腺泡表面的MEC是否隨腺泡消失而自身發(fā)生凋亡，還是遷移到新增的導管樣結構表面，仍需進一步研究。此外，60 d組MEC數(shù)量較30 d時減少，100 d達到峰值，150 d又迅速減少。通過觀察腮腺的組織學變化可以發(fā)現(xiàn)：30 d時腺實質內存在大量小的圓形導管樣結構；60 d時出現(xiàn)大的不規(guī)則的導管樣結構，管腔擴張；100 d時可見導管樣結構異形明顯；150 d時異形導管及導管樣結構數(shù)量減少，管腔變?。淮送膺€發(fā)現(xiàn)鄰近導管樣結構有融合趨勢。因此可以認為：30～150 d內的腮腺萎縮過程中，受間質結締組織纖維化壓力作用的影響，相鄰多個小導管樣結構發(fā)生融合形成大的不規(guī)則導管樣結構，該改建過程引起MEC數(shù)量的暫時增加，融合完畢后受周圍壓力的繼續(xù)影響，最終導致MEC數(shù)量減少，導管樣結構異形減少，管腔變小并逐漸呈圓形。因此，在唾液腺萎縮晚期MEC所環(huán)繞的大導管的擴張，除考慮小導管融合外，亦與對腮腺的萎縮抑制效應有關。

總之，在腮腺導管結扎5 d后，MEC呈現(xiàn)反應性大量增殖，隨后數(shù)量增長緩慢，維持在一定的范圍內，隨著腮腺腺體的萎縮，100 d后MEC數(shù)量快速減少，150 d時接近正常水平。此外，MEC在腮腺萎縮過程中的形態(tài)變化，可對判斷腺體萎縮程度及選擇治療時機提供理論依據(jù)。通過研究MEC在腮腺萎縮過程中的轉歸規(guī)律，對唾液腺輻射防護及腺體萎縮的治療具有積極的指導意義。

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（本文編輯 吳愛華）