楊尊　劉婷　鄭鴻等

[摘要] 目的 轉染猿腎病毒SV40Tag基因片段至SD大鼠牙囊細胞，獲取具有無限增殖能力和穩(wěn)定生物學性狀的牙囊細胞用于牙周組織工程的研究。方法 利用293細胞包裝病毒構建含SV40Tag的逆轉錄病毒載體，制備重組逆轉錄病毒并轉染至SD大鼠牙囊細胞。以正常牙囊細胞為對照，倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)及活力，分析細胞端粒酶活性，并檢測其成骨分化及增殖特性。結果 轉染SV40Tag基因后，SD大鼠牙囊細胞傳代至60代，生長依然旺盛，存在較強活力；牙囊細胞端粒酶活性顯著增強，與對照組有統(tǒng)計學差異（P=0.033）；牙囊細胞成骨分化相關基因（堿性磷酸酶、骨鈣素、骨形態(tài)發(fā)生蛋白、Runx2基因）、促有絲分裂相關基因（堿性成纖維細胞生長因子、胰島素樣生長因子）的電泳條帶與對照組均無統(tǒng)計學差異（P>0.05）。結論 SV40Tag基因片段轉染SD大鼠牙囊細胞后具有無限傳代增殖和抗衰老的潛在能力，其細胞生物學特性相對穩(wěn)定，可為牙周組織工程提供較理想的種子細胞來源。

[關鍵詞] 牙囊細胞； 基因轉染； 端粒酶； 成骨分化； 增殖

[中圖分類號] Q 813 [文獻標志碼] A [doi] 10.7518/hxkq.2013.01.002 牙囊細胞（dental follicle cells，DFC）來源于形成牙周組織始基的牙囊[1]，系牙周組織工程研究中受到廣泛關注的種子細胞之一[2]。數(shù)量豐富并且細胞表型

和生物學性質穩(wěn)定的種子細胞是牙周組織工程研究的前提[3]，但是牙囊細胞體外培養(yǎng)的數(shù)量較少，容易

失去自我更新能力發(fā)生老化。通過轉染外源性基因片段至目的細胞可以抑制細胞的衰亡，使有限的生命細胞轉化成為具有長期傳代能力和穩(wěn)定表型的細胞。

猿腎病毒SV40大T抗原（simian virus 40 large tu-mor antigen，SV40Tag）是較常用和有效的外源性基

因之一[4]，目前國內外已成功將其用于牙骨質細胞

以及牙周膜成纖維細胞[5]的永生化構建。本研究將

SV40Tag基因片段轉染至體外培養(yǎng)的SD大鼠牙囊細胞，對其傳代增殖能力和抗衰老能力、成骨分化及細胞增殖等生物學特征進行觀察和檢測，為牙周組織工程研究的種子細胞來源提供實驗基礎。

1 材料和方法

1.1 材料

1周齡SD大鼠由重慶醫(yī)科大學實驗動物中心提供，含SV40Tag片段質粒pSSR69、pAmpho、293細胞均由重慶醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院羅進勇教授惠贈，胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基（Hyclone公司，美國），胰酶、Ⅰ型膠原酶、脂質體2000、二甲基亞砜（dimethyl sul-foxide，DMSO）、聚凝胺（polybrene）、潮霉素（hygro-mycin）（Sigma公司，美國），端粒酶逆轉錄酶（telome-rase reverse transcriptase，TRT）抗體、山羊抗兔二抗、甘油醛三磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）（Cell Signaling Technology公司，美國），焦碳酸二乙酯（diethypyrocarbonate，DEPC）（Bio Basic公司，美國），Rever Tre Ace-a-逆轉錄試劑盒、SYBRGreen逆轉錄試劑盒（Toyobo公司，日本），瓊脂糖（TaKaRa公司，日本）。

1.2 牙囊細胞體外培養(yǎng)及SV40Tag基因轉染

將SD大鼠引頸法處死后取出下頜第一磨牙牙胚，分離出牙囊組織立即置入DMEM培養(yǎng)基并剪成l～2 mm大小的組織塊。加入0.1%Ⅰ型膠原酶37 ℃水浴消化1 h，0.25%胰蛋白酶消化5 min，離心棄上清液。加入DMEM培養(yǎng)基3 mL轉入培養(yǎng)瓶。5%CO2、37 ℃、飽和濕度條件下培養(yǎng)，2～3 d換液1次，細胞生長形成單層后常規(guī)消化傳代并鑒定細胞來源。37 ℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細胞融合至75%～80%時胰蛋白酶消化傳代。

利用293細胞包裝病毒構建含SV40Tag的逆轉錄病毒載體，制備重組逆轉錄病毒并轉染至SD大鼠牙囊細胞。方法：將293細胞按30%～40%密度鋪于T-25細胞培養(yǎng)瓶，待細胞貼壁（8～12 h）后，設置轉染體系，將含有SV40Tag片段的pSSR69質粒1～2 μg、pAmpho質粒0.5～1.0 μg、脂質體2000 15 μL、DMEM（無血

清、無雙抗）250 μL混合均勻，室溫放置15～20 min。將T-25細胞培養(yǎng)瓶中293細胞用3 mL無血清、無雙抗的DMEM洗滌2遍，再加入無血清、無雙抗的DMEM 2.5 mL。將設置好的轉染體系加入細胞培養(yǎng)瓶，輕柔混合均勻。3～5 h后，將培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)基換成完全DMEM 4 mL，在繼續(xù)培養(yǎng)36、60、84、108 h后，分別收集細胞上清液（含有轉染體系），合計收集約16 mL，低速離心5 min去除細胞懸液，0.22～0.45 μm醋酸纖維膜濾器過濾，4 ℃保存?zhèn)溆谩⒀滥壹毎?0%～30%密度鋪于T-25細胞培養(yǎng)瓶，等待細胞貼壁。在含有轉染體系的293細胞培養(yǎng)上清液中加入80～100 μL聚凝胺，吸取SD大鼠牙囊細胞培養(yǎng)基，換成含有轉染體系的細胞培養(yǎng)上清液4 mL，6～8 h后吸出上清液，再加入含有轉染體系的細胞培養(yǎng)上清液

4 mL，過夜培養(yǎng)，第2天換成完全DMEM 4 mL，培養(yǎng)4 h。2 μg·mL-1潮霉素篩選。

1.3 細胞形態(tài)學觀察

以轉染SV40Tag后的DFC為實驗組，正常DFC為對照組，連續(xù)傳代至60代。在倒置相差顯微鏡下觀察2組的細胞形態(tài)及生長狀態(tài)。

1.4 轉染SV40Tag基因前后DFC端粒酶表達的檢測

采用蛋白質印跡技術（Western blot）檢測轉染

SV40Tag基因前后DFC端粒酶的表達。以轉染SV40-Tag后的DFC為實驗組，正常DFC為對照組。用預冷的PBS液清洗細胞，提取蛋白質于-20 ℃保存。配置工作液，酶標儀測定562 nm處的吸光度，繪制標準曲線蛋白定量。上樣50 μg進行電泳，轉膜，去除氣泡，同時保持膠的濕潤。將其放入電泳槽，膠面向陰極，然后放入充滿緩沖液的緩沖槽，4 ℃電泳過夜后取出，棄膠。將膜放入染液中快速染色，然后放置于封閉液中，37 ℃下?lián)u晃4 h。5%的脫脂奶粉脫色搖床上洗膜15 min，封TRT一抗（1∶400）4 h，封二抗（1∶2 000）2 h，洗膜，顯影。應用Image tool V

3.0圖像分析軟件進行圖像分析，計算轉染SV40Tag基因前后DFC的灰度值以及相應的內參GAPDH灰度值。

1.5 轉染SV40Tag基因前后DFC成骨分化相關基因

表達的檢測

采用逆轉錄聚合酶鏈式反應（reverse transcription PCR，RT-PCR）檢測轉染SV40Tag基因前后DFC成骨分化相關基因的表達。以轉染SV40Tag后的DFC為實驗組，正常DFC為對照組，細胞消化后接種于96孔板，培養(yǎng)于加有礦化誘導液（地塞米松1×10-8 mol·L-1，β-甘油磷酸鈉50 mg·L-1，維生素C 10 mmol·L-1）的培養(yǎng)基中誘導其骨向分化，于第6天提取細胞總RNA，逆轉錄獲取cDNA，按逆轉錄試劑盒說明書，在冰盒中配置20 μL合成體系，加入1 μL cDNA為模板進行擴增。RT-PCR法檢測2組細胞內堿性磷酸酶（alka-

line phosphatase，ALP）、骨鈣素（osteocalcin，OC）、

骨形態(tài)發(fā)生蛋白（bone morphogenesis protein，BMP）2、Runx2基因的表達。各引物序列見表1。反應產物進行瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙啶染色，紫外燈下觀察電泳條帶并拍照記錄。

1.6 轉染SV40Tag基因前后DFC促有絲分裂相關基

因表達的檢測

RT-PCR法檢測轉染SV40Tag基因前后DFC促有絲分裂相關基因的表達。以轉染SV40Tag后的DFC為實驗組，正常DFC為對照組，檢測堿性成纖維細胞生長因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）、胰島素樣生長因子（insulin-like growth factors，IGF）的表達。引物序列見表2。反應產物進行瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙啶染色，紫外燈下觀察電泳條帶并拍照記錄。

2 結果

2.1 細胞生長情況觀察

原代培養(yǎng)12 h后，倒置顯微鏡下見已貼壁的細胞呈梭形或多角形，胞體豐滿，胞突細長，細胞質豐富均勻，核圓居中。原代培養(yǎng)6～7 d后，可按1∶2進行傳代。傳代9～10代后，細胞胞體變圓，結構模糊，細胞質內出現(xiàn)顆粒，細胞增殖明顯減慢，提示細胞呈衰老征象。

轉染SV40Tag基因后，DFC細胞以多角形居多，呈束狀、柵欄狀或旋渦狀排列（圖1）。細胞傳代至60

代，生長依然旺盛，存在較強活力。對照組DFC傳代至9～10代后細胞活性降低，出現(xiàn)凋亡，難以繼續(xù)傳代。

Fig 1 Morphology of DFC infected with SV40Tag inverted mi-

croscope × 200

2.2 轉染SV40Tag基因前后DFC端粒酶的表達

Western blot檢測表明，實驗組TRT灰度值明顯高于對照組（圖2），二者之間有統(tǒng)計學差異（P=0.033），表明轉染SV40Tag基因后DFC端粒酶活性明顯增強。

Fig 2 The TRT expression of DFC

2.3 轉染SV40Tag基因前后DFC成骨分化相關基因的

表達

經RT-PCR擴增后，可見GAPDH擴增片段大小為500 bp，實驗組和對照組的ALP、OC、BMP2、Runx2基因的電泳條帶均無統(tǒng)計學差異（P>0.05，圖3）。

Fig 3 Expression of ALP， OC， BMP2 and Runx2 by RT-PCR

2.4 轉染SV40Tag基因前后DFC促有絲分裂相關基因

的表達

經RT-PCR擴增后，可見GAPDH擴增片段大小為

500 bp，實驗組和對照組的bFGF、IGF基因的電泳條帶均無統(tǒng)計學差異（P>0.05，圖4）。

Fig 4 Expression of bFGF and IGF by RT-PCR

3 討論

牙囊細胞作為牙周組織分化發(fā)育的前體細胞，體外培養(yǎng)難度較大，細胞量較少且傳代易衰亡[6]。普通

牙囊細胞經過20～30群體倍增次數(shù)后即進入危機期，細胞開始出現(xiàn)衰亡、退化[7]，難以獲得數(shù)量較多且

性狀一致的細胞。隨著基因轉染技術的出現(xiàn)，將外源性基因轉入目的細胞，可誘導衰老相關基因突變，使有限的生命細胞逾越危機期，獲得極強的傳代增殖能力[8]。SV40Tag是目前較為常用且有效的體外永生化細胞的基因片段之一，可以通過與生長抑制因子pRB、p53和SEN6相互作用[9]，使細胞最終度過危機期避免細胞凋亡，從而達到無限傳代增殖效應且無致瘤性[10]。本研究將SV40Tag通過脂質體轉染至SD大鼠DFC后，細胞傳代達60代，細胞生長依然旺盛且細胞活力不變。

端粒是線形染色體末端的一種特殊結構，能防止染色體末端融合維持細胞染色體的穩(wěn)定[11]。普通

細胞中端粒的長度會隨著細胞分裂逐漸縮短，進而衰老死亡，因此維持端粒的長度成為阻止細胞衰老的方法之一[12]。本研究對轉染SV40Tag前后的DFC細胞進行TRT檢測，發(fā)現(xiàn)實驗組TRT灰度值明顯高于對照組，證明轉染SV40Tag后DFC的端粒酶被激活，端粒長度增加，提示轉染SV40Tag后的DFC具備抗衰老的特性。

轉染SV40Tag后的DFC獲得了極強的傳代和抗衰老能力，但其成骨分化和細胞增殖特性與正常牙囊細胞有無差異尚需要進一步的研究。ALP是細胞向成骨細胞分化的早期標志[13]，OC是成骨活性細胞分化晚期的重要標志[14]，Runx2基因是成骨細胞分化的

特異性轉錄因子[15]，BMP2通過信號轉導上調成骨

調控基因的轉錄直接及間接地促進成骨分化[16]。本

實驗結果表明，實驗組與對照組細胞內ALP、OC、BMP2、Runx2的表達均無統(tǒng)計學差異，說明SV40Tag轉染大鼠DFC后成骨早期和晚期分化能力以及成骨特異性因子的轉錄與正常牙囊細胞均無明顯差異，保持了相對一致性。IGF和bFGF[17]作為一種多肽生長因子，可促進細胞在同一生長周期內的增殖活性。本研究結果顯示，大鼠DFC轉染SV40Tag基因前后的IGF-1及bFGF表達水平均不具有統(tǒng)計學差異，表明轉染SV40Tag后大鼠DFC在細胞周期內增殖活性與正常牙囊細胞無明顯差異，保持了功能狀態(tài)的穩(wěn)定。

本研究通過轉染SV40Tag基因片段至SD大鼠牙囊細胞，對其生物學特性觀察檢測，結果發(fā)現(xiàn)轉染SV40Tag后的DFC獲得了無限傳代增殖和抗衰老的能力，染色體端粒長度得以維持。同時該細胞保持了與正常牙囊細胞相對一致的成骨分化特性和增殖活性，表明其生物學性質穩(wěn)定，有望成為牙周組織工程研究中較理想的種子細胞來源。

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（本文采編 王晴）