潘騰飛 朱學亮等

摘 要： 【目的】為了探討‘琯溪蜜柚貯藏過程中汁胞?；c木質(zhì)素的關(guān)系，以及外源激素對木質(zhì)素合成與汁胞粒化的影響，【方法】以‘琯溪蜜柚果實為材料，利用水楊酸（SA）處理低溫貯藏的‘琯溪蜜柚果實，測定了貯藏過程中汁胞?；笖?shù)、木質(zhì)素含量以及木質(zhì)素合成途徑中關(guān)鍵酶的活性?！窘Y(jié)果】結(jié)果表明，汁胞?；笖?shù)、木質(zhì)素含量、木質(zhì)素合成關(guān)鍵酶的活性在整個貯藏過程中逐漸升高，SA處理的木質(zhì)素合成的關(guān)鍵酶PAL、CAD和POD的活性均顯著低于對照，木質(zhì)素含量和粒化指數(shù)也顯著低于對照。木質(zhì)素含量與粒化指數(shù)的相關(guān)系數(shù)為0.943，木質(zhì)素合成酶的活性與木質(zhì)素含量的相關(guān)系數(shù)為0.981?！窘Y(jié)論】研究認為，‘琯溪蜜柚采后貯藏期間汁胞?；潭扰c汁胞中木質(zhì)素含量為正相關(guān)的關(guān)系，適宜濃度的SA對汁胞?；囊种谱饔弥饕峭ㄟ^抑制木質(zhì)素合成途徑中關(guān)鍵酶的活性，減少木質(zhì)素的合成，從而減輕汁胞粒化的程度。

關(guān)鍵詞： ‘琯溪蜜柚； 汁胞粒化； 水楊酸； 木質(zhì)素

中圖分類號：S666.3 文獻標志碼：A 文章編號：1009-9980？穴2013？雪02-0294-05

汁胞?；歉涕兕惞麡涑Ｒ姷囊环N生理現(xiàn)象?！g溪蜜柚[Citrus grandis （L.） Osbeck ‘Guanximiyou]的汁胞?；浅墒旌笃诤筒珊筚A藏期間發(fā)生的生理病害，其主要表現(xiàn)為汁胞異常膨大、變硬，有汁胞木質(zhì)化，汁味變淡，造成果實食用品質(zhì)下降，甚至喪失商品價值，給果農(nóng)帶來很大的經(jīng)濟損失。潘東明等[1]研究發(fā)現(xiàn)‘琯溪蜜柚汁胞在?；^程中伴隨著細胞壁加厚，纖維、半纖維增多，高爾基體增加，核體積增大，并且?；麜霈F(xiàn)多核仁現(xiàn)象。木質(zhì)素是由木質(zhì)素單體經(jīng)氧化耦合形成的化合物，其氧化過程主要發(fā)生在次生加厚的細胞壁[2-3]。Ilan等[4]觀察到柚汁胞?；c汁胞細胞的木質(zhì)化有直接關(guān)系，但與汁胞中木質(zhì)素合成的關(guān)系尚未明確。

木質(zhì)素單體的合成主要經(jīng)過苯丙酸途徑進行，包括了子系列的酶促反應和羥基化、甲基化及還原反應，最終生成3種單體物質(zhì)[2]，合成的木質(zhì)素單體被過氧化物酶或者漆酶氧化成木質(zhì)素[3， 5-6]。木質(zhì)素生物合成途徑的關(guān)鍵酶包括苯丙氨酸解氨酶（PAL）、肉桂醇脫氫酶（CAD）和過氧化物酶（POD）等[7]。在枇杷中的研究發(fā)現(xiàn)，水楊酸（salicylic acid，SA）能抑制低溫貯藏過程中PAL、CAD和POD的活性[8]。潘東明等[9]研究表明KT、2，4-D、NAA等能抑制汁胞?；陌l(fā)生和發(fā)展，但未見SA抑制柚汁胞?；l(fā)生的報道，且SA與木質(zhì)素合成的關(guān)系尚不明確。我們擬用SA處理成熟的‘琯溪蜜柚果實，探討在貯藏過程中，木質(zhì)素的合成與汁胞粒化的關(guān)系，以及外源激素SA如何影響木質(zhì)素的合成與汁胞粒化的發(fā)生。

1 材料和方法

1.1 材料

供試材料采自福建省漳州市平和縣新橋鎮(zhèn)小溪村大坑果園內(nèi)1株30 a樹齡的‘琯溪蜜柚樹，于成熟期采果，每個處理60個果，采收后立即送至實驗室。預冷的‘琯溪蜜柚果實分別采用0.5 g·L-1（SA1）、1.0 g·L-1（SA2）和1.5 g·L-1（SA3）水楊酸（SA）浸果60 min處理，然后晾干，裝入保鮮袋；以不浸泡處理為對照，均置于7 ℃下貯藏。貯藏過程中每20 d取出部分果實用于試驗，各處理均設(shè)置3次重復。

觀察‘琯溪蜜柚果的?；闆r，記錄粒化指數(shù)，并從中隨機取?；臀戳；闹糜谀举|(zhì)素含量和相關(guān)酶活性的測定。

1.2 方法

1.2.1 ‘琯溪蜜柚?；笖?shù)的統(tǒng)計 果實?；潭扔昧；笖?shù)表示，按照潘東明等[1]的方法統(tǒng)計。

1.2.2 汁胞木質(zhì)素含量的測定 參照鞠志國[10]的方法，取3.5 g汁胞加入10 mL沸水，冷卻后加入86% H2SO4 25 mL，室溫下充分攪拌水解4 h，后加入蒸餾水250 mL，加熱煮沸1 h，冷卻后用預先烘干至恒質(zhì)量的G4砂心漏斗抽濾，再用蒸餾水洗滌，洗滌液用10% BaCl2檢查，以不出現(xiàn)BaSO4沉淀為止，G4砂心漏斗烘干后稱重。

1.2.3 汁胞PAL活性的測定 參照Cheng等[11]的方法，并略作修改。

PAL的提?。?取1 g汁胞于研缽中，并加入少量的提取介質(zhì)，冰浴研磨成勻漿，攪勻，10 000 ×g離心15 min。上清液即為待測酶液。

PAL的測定： 反應體系含1.0 mL酶液、0.02 mol·L-1的L-苯丙氨酸1.0 mL和0.05 mol·L-1 pH 8.8硼酸緩沖液2 mL，總體積為4.0 mL。反應液于290 nm測其吸光值，以反應液1 h變化0.001吸光值為1個酶活性單位，PAL活性以U·g-1 FW表示，重復測定3次。

1.2.4 汁胞CAD 活性的測定 參照Goffner等[12]的方法。反應液含有0.2 mL酶提取液，6.4 mmol·L-1的NADP 1.25 mL， 3.2 mmol·L-1的松柏醇1.25 mL，pH 6.5磷酸緩沖液1.3 mL，總體積4.0 mL。于340 nm處測定其吸光值，以1 min變化0.001吸光值為1個酶活性單位，CAD活性以U·g-1 FW表示，測定3次重復。

1.2.5 汁胞 POD活性的測定 參照Meloni等[13]的方法測定。

酶液提?。?稱取汁胞樣品1 g，加入5 mL 50 mmol·L-1 pH 7.0 PBS（含10%PVP），冰浴研磨，于15 000×g低溫4 ℃離心20 min，取上清液供POD測定用。每個樣品重復3次。

POD活性測定： 參照Meloni等[13]的方法。反應混合液由0.2 mol·L-1 PBS （pH 6.0） 50 mL、H2O2 （30%） 0.028 mL和愈創(chuàng)木酚0.019 mL混合而成。測定時取10 μL酶液加反應混合液3 mL混勻，參比為50 mmol·L-1 pH 7.0 PBS 10 μL加反應混合液3 mL混勻，測定A470值，靜置5 min后，再測A470的值，并計算差值。POD活性以ΔA470 ·min-1·g-1表示（鮮質(zhì)量計）。

POD活性按下式計算：

POD活性=（ΔA470 VT）/（0.01WF·V1·T）

以每分鐘ΔA470變化0.01為1個POD活性單位（U）。VT表示提取液總體積（mL）；V1表示測定時用去酶液體積（mL）；T表示反應時間（min）。

2 結(jié)果與分析

2.1 ‘琯溪蜜柚貯藏期間?；笖?shù)的統(tǒng)計

在貯藏過程中，各處理的汁胞?；笖?shù)均隨著貯藏期的延長而逐漸上升（圖1）。在貯藏40 d前，對照組和0.5 g·L-1 SA處理的?；笖?shù)顯著上升，而1.0 g·L-1和0.5 g·L-1 SA處理的汁胞?；笖?shù)無顯著差異，貯藏40 d后，汁胞粒化指數(shù)顯著升高，不同濃度SA處理的柚果汁胞?；笖?shù)均顯著低于對照，其中1.0 g·L-1 SA處理能較好地減少汁胞粒化的發(fā)生。

2.2 ‘琯溪蜜柚貯藏期間汁胞木質(zhì)素含量的變化

對照處理和SA處理的‘琯溪蜜柚在貯藏40 d后汁胞木質(zhì)素的含量均顯著升高。在采后貯藏40 d至60 d期間，各處理的木質(zhì)素含量急劇增加，但SA處理能顯著減緩蜜柚汁胞木質(zhì)素含量的升高，其中1.0 g·L-1 SA處理的效果最顯著（圖2）。結(jié)果表明，貯藏期間隨著木質(zhì)素的積累，汁胞木質(zhì)化程度隨之升高，木質(zhì)素含量的增加與?；笖?shù)的變化呈顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.943，說明汁胞?；赡苁怯赡举|(zhì)素累積到一定量后引起的生理變化，SA能減少木質(zhì)素的合成，降低?；笖?shù)。

2.3 ‘琯溪蜜柚貯藏期間木質(zhì)素合成相關(guān)酶活性的測定

圖3表明，各處理的‘琯溪蜜柚在貯藏過程中，汁胞PAL活性呈先上升后下降的趨勢。貯藏20～40 d期間，對照組的PAL活性顯著上升，且顯著高于同時期的SA處理，在貯藏第40天出現(xiàn)PAL活性高峰，之后顯著下降；在此期間（貯藏20～60 d）SA處理的PAL活性呈上升趨勢，在貯藏60 d后0.5 g·L-1 SA處理組的PAL活性達到高峰，而后下降；1.0 g·L-1和1.5 g·L-1 SA處理組的PAL活性在貯藏第80天出現(xiàn)高峰，而后略有下降，處理說明SA處理能降低汁胞PAL活性且延緩其峰值的出現(xiàn)。

由圖4可以看出，不同處理的‘琯溪蜜柚在貯藏過程中，汁胞CAD活性均逐漸上升。對照組在貯藏20～60 d，活性顯著上升，并高于SA處理，而SA處理的CAD活性在貯藏40～60 d才出現(xiàn)顯著升高的變化，說明適宜濃度的SA處理能顯著降低汁胞CAD的活性。結(jié)果表明，果實在貯藏期間CAD活性的變化與木質(zhì)素的合成呈顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.981。

由圖5可以看出，各處理組的‘琯溪蜜柚汁胞POD活性在貯藏期間逐漸上升。貯藏前20 d，對照組的POD活性即出現(xiàn)顯著升高的現(xiàn)象，而SA處理組的POD活性無顯著變化，貯藏20 d后POD活性才顯著上升。SA處理果的POD活性及其上升速度顯著低于對照，其中1.0 g·L-1 SA抑制POD酶活性的效果最佳。

研究結(jié)果表明，在‘琯溪蜜柚的貯藏過程中，木質(zhì)素生物合成關(guān)鍵酶PAL、CAD和POD的活性與木質(zhì)素的含量和汁胞的?；潭扔邢嚓P(guān)性；適宜濃度的外源激素SA處理能夠抑制PAL、CAD的生物合成過程。

3 討 論

研究表明，汁胞?；c木質(zhì)素有關(guān)。Shomer等[14]認為汁胞粒化是汁胞木質(zhì)化形成厚壁組織的結(jié)果，通過對?；慕馄剩^察到囊壁細胞的次生木質(zhì)壁內(nèi)鑲物和復飾物的木質(zhì)化造成了?；F(xiàn)象[15]，本研究結(jié)果表明，木質(zhì)素含量與汁胞粒化指數(shù)呈顯著正相關(guān)，進一步證明了木質(zhì)素的生成是汁胞木質(zhì)化的主要原因之一。

在木質(zhì)素合成途徑中，PAL是苯丙氨酸途徑的第1個關(guān)鍵酶，催化L-苯丙氨酸生成反式肉桂酸，最后形成木質(zhì)素的酚類前體，是一個限速酶，CAD催化松柏醛形成木質(zhì)素單體[16]，POD則將可溶性的木質(zhì)素單體氧化聚合成不溶性的木質(zhì)素聚合體，抑制這3種酶的活性能夠抑制木質(zhì)素的生成[17]。本研究結(jié)果表明，‘琯溪蜜柚在貯藏期間，PAL、CAD和POD與木質(zhì)素合成密切相關(guān)，SA能顯著抑制木質(zhì)素合成關(guān)鍵酶PAL、CAD和POD的活性，從而抑制木質(zhì)素的合成。

SA是植物內(nèi)普遍存在的一種酚類化合物[18]，被認為是一種植物內(nèi)源信號分子和新的植物激素，能夠干擾赤霉素（GA）的信號傳導或響應，從而抑制細胞木質(zhì)素合成相關(guān)酶基因的表達，進而影響植物的生長[19]。吳錦程等[20]用1.0 g·L-1 SA處理貯藏期間的枇杷果實，試驗結(jié)果證明外源SA能顯著抑制PAL、PPO、CAD和POD的活性，降低果實木質(zhì)素含量，減緩果實的木質(zhì)化。在本研究中，外源SA能顯著抑制貯藏期間‘琯溪蜜柚?；笖?shù)的上升，其原因可能是外源SA抑制了木質(zhì)素合成途徑中相關(guān)基因的表達，因此表現(xiàn)為SA處理組的相關(guān)酶活性顯著低于對照組，減少木質(zhì)素的生成，減輕汁胞木質(zhì)化程度。

4 結(jié) 論

‘琯溪蜜柚采后貯藏期間汁胞?；潭扰c汁胞中木質(zhì)素含量有直接的關(guān)系，SA對汁胞?；囊种剖峭ㄟ^抑制木質(zhì)素合成途徑中關(guān)鍵酶的活性，以減少木質(zhì)素的合成，從而減輕汁胞粒化的程度。

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