龍順榮，周勇，酈明浩，譚錦萍，楊曉云

1(廣東產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)研究院，廣東廣州，510330)2(華南農(nóng)業(yè)大學(xué)資源環(huán)境學(xué)院，廣東廣州，510642)

氨基甲酸乙酯(ethyl carbamate，EC)存在于飲料酒、焙烤食品、調(diào)味品等發(fā)酵食品中，是發(fā)酵過(guò)程副產(chǎn)物，早在1943年被Nettleship證實(shí)為一種多位點(diǎn)致癌物，會(huì)導(dǎo)致肺癌、淋巴癌、肝癌和皮膚癌等疾?。?－2］，并影響人體免疫系統(tǒng)，乙醇對(duì)EC的致癌性有促進(jìn)作用［3－4］，2007 年國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)(IARC)指出，EC對(duì)人類的致癌毒性為2A群［5］。1985年加拿大最先規(guī)定酒中EC限量，隨后美、德、法、韓等國(guó)都相應(yīng)規(guī)定EC含量限值，2002年聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織(FAO)將EC列為重點(diǎn)監(jiān)控物質(zhì)，并制定國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)，我國(guó)已經(jīng)制定飲料酒中EC的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)，但沒(méi)有制定發(fā)酵食品EC的限值［6－15］。本研究采用液液萃取和基質(zhì)固相分散的樣品前處理技術(shù)，應(yīng)用氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜的檢測(cè)方法，開(kāi)展流通領(lǐng)域發(fā)酵食品中EC的污染狀況調(diào)查，為發(fā)酵食品中EC的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估和制定限值提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

本研究的樣品來(lái)源于流通領(lǐng)域，主要分析流通領(lǐng)域中飲料酒、焙烤食品和調(diào)味品中EC的污染狀況，共采集發(fā)酵食品437批次，其中62批次葡萄酒，37批次黃酒，3批次果酒，4批次啤酒，73批次蒸餾酒，45批次配制酒，109批次醬油，75批次醋，29批次面包。

1.2 儀器與試劑

Agilent 7000A三重四級(jí)桿氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀:配有Agilent Masshunter化學(xué)工作站，美國(guó)安捷倫公司;Eyela SB-1100旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海愛(ài)朗儀器有限公司;Milli-Q超純水器，美國(guó)Millipore公司;Sigma 3－18K高速離心機(jī)，德國(guó)SIGMA公司;DC-12氮吹儀，上海安譜科學(xué)儀器有限公司。

二氯甲烷、正己烷、無(wú)水Na2SO4、活性炭、NaCl:分析純，廣州化學(xué)試劑廠;硅藻土:化學(xué)純，廣州市產(chǎn)品質(zhì)量檢驗(yàn)技術(shù)開(kāi)發(fā)公司進(jìn)口分裝;硅膠:60～100目，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;氨基甲酸乙酯標(biāo)準(zhǔn)品:≥99%，美國(guó)Sigma-Aldrich公司。

1.3 氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜條件

色譜條件:毛細(xì)管柱DB-225MS，30 m×0.25 mm×0.25 μm，進(jìn)樣口溫度 230℃，氦氣流速 1.0 mL/min，不分流，初始溫度50℃保持1 min，以8℃/min升至120℃，以40℃/min升至230℃保持10 min。

質(zhì)譜條件:EI離子源溫度300℃，傳輸線溫度230℃，溶劑延遲8 min，碰撞氣:氦氣1.5 mL/min、氮?dú)?.25 mL/min，碰撞能量25eV;采用MRM方式進(jìn)行定性定量，母離子m/z 62，定量離子m/z 44，定性離子m/z 45。

1.4 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液和標(biāo)準(zhǔn)系列溶液配制

稱取適量的氨基甲酸乙酯標(biāo)準(zhǔn)品于100 mL容量瓶中，用二氯甲烷稀釋定容，使該溶液每毫升含氨基甲酸乙酯1 mg，冷藏于冰箱中，有效期2個(gè)月。分別吸取適量的氨基甲酸乙酯標(biāo)準(zhǔn)貯備液于100 mL容量瓶中，用二氯甲烷定容至刻度，配成 10 μg/L，50 μg/L，100 μg/L，250 μg/L，500 μg/L，1 000 μg/L 標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。

1.5 樣品處理

1.5.1 飲料酒

取20.0 mL酒于150 mL分液漏斗中，加入20 mL水和適量NaCl使樣品達(dá)到飽和，再加20 mL正己烷，振搖5 min，靜置分層后用吸管吸出正己烷層，棄去，然后用50 mL×3次二氯甲烷萃取，振搖5 min，合并有機(jī)相過(guò)無(wú)水Na2SO4，濃縮至3 mL左右，轉(zhuǎn)入10 mL刻度試管中，用少量二氯甲烷洗滌濃縮瓶2至3次，洗滌液轉(zhuǎn)入試管中，氮吹，定容至5.0 mL，過(guò)濾上機(jī)。

1.5.2 焙烤食品、調(diào)味品

取5.0 g樣品于裝有10 g硅藻土∶無(wú)水Na2SO4(1∶1)的研缽中研勻。向玻璃層析柱中依次加入1 cm無(wú)水Na2SO4、0.5 g 10%活性炭硅膠、1 cm無(wú)水Na2SO4、樣品、2 cm無(wú)水Na2SO4。打開(kāi)層析柱活塞，加入40 mL正己烷洗脫非極性成分，流速控制為8 mL/min，棄去流出液，加入100 mL二氯甲烷洗脫，流速最大時(shí)收集洗脫液，濃縮至3 mL左右，轉(zhuǎn)入10 mL刻度試管中，用少量二氯甲烷洗滌濃縮瓶2至3次，洗滌液轉(zhuǎn)入試管中，氮吹，定容至5.0 mL，過(guò)濾上機(jī)。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線和方法檢出限

以EC的子離子m/z 44峰面積與其對(duì)應(yīng)濃度作線性回歸，得標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=21.8922x－75.2654，相關(guān)系數(shù)r=0.9995，EC在10～1 000 μg/L范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，說(shuō)明本方法可以對(duì)發(fā)酵食品中EC進(jìn)行準(zhǔn)確的定性定量分析，以標(biāo)準(zhǔn)品在儀器上最低可檢出的濃度代入前處理過(guò)程中計(jì)算飲料酒中EC方法檢出限為1.0 μg/L，焙烤食品和調(diào)味品為5.0 μg/kg。

2.2 方法回收率及精密度

選取EC含量較低的樣品為基底樣品，根據(jù)方法檢出限和樣品實(shí)際檢出范圍，進(jìn)行不同濃度加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，每類樣品按照1.5的方法進(jìn)行樣品前處理，平行測(cè)定5次，按照1.3小節(jié)的條件測(cè)定EC的含量并計(jì)算樣品回收率及其平均值和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，具體結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 回收率和精密度測(cè)定結(jié)果(n=5)Table 1 Determination results of recovery and precision(n=5)

2.3 樣品處理

飲料酒前處理靜置后若二氯甲烷和水層不能分離，出現(xiàn)乳化嚴(yán)重現(xiàn)象，可以先將樣品轉(zhuǎn)入離心管中離心分層，再緩緩轉(zhuǎn)入分液漏斗中。焙烤食品、調(diào)味品前處理僅僅以硅藻土為吸附劑，以二氯甲烷為洗脫劑，則洗脫劑的用量比較大，且洗脫下來(lái)的油脂、色素和其他雜質(zhì)較多，以1∶1的硅藻土－無(wú)水Na2SO4為吸附劑，可以達(dá)到吸附效果，并且在玻璃層析柱中占用體積小，使得洗脫劑的用量減少而降低其它雜質(zhì)，用10%活性炭硅膠不但可以吸附色素，也可以吸附雜質(zhì)。由于氨基甲酸乙酯具有升華的性質(zhì)，樣品濃縮和氮吹時(shí)水浴溫度不要超過(guò)40℃，不能濃縮或者氮吹干，濃縮和氮吹時(shí)溶液體積不要少于3 mL，否則會(huì)影響氨基甲酸乙酯的回收率。

2.4 樣品中EC污染狀況

本研究樣品來(lái)源于廣東省流通領(lǐng)域，基本上涵蓋了主要的發(fā)酵食品分布情況，具有良好的代表性，本研究共監(jiān)測(cè)437批次發(fā)酵食品，其中陽(yáng)性樣品343批次，陽(yáng)性率為78.49%，具體情況見(jiàn)表2。

共監(jiān)測(cè)224批次飲料酒，各類飲料酒中EC平均值從高到低依次為黃酒、保健酒、果酒、高粱酒、米酒、料酒、雙蒸酒和葡萄酒，其中最高黃酒為90.4 μg/L，其次為保健酒62.9 μg/L，最低葡萄酒為7.6 μg/L;按食品類別統(tǒng)計(jì)含量最大值，最高值為保健酒255.1 μg/L，其次為黃酒228.2 μg/L，最低值為雙蒸酒17.2 μg/L;按照陽(yáng)性率統(tǒng)計(jì)，最高為果酒100%，其次是黃酒78.38%，最低為啤酒未檢出 EC。對(duì)照加拿大1985年制定的葡萄酒EC限值(30 μg/L)，葡萄酒超標(biāo)率為1.6%(1/62)，對(duì)照加拿大日本清酒EC限值(200 μg/L)，黃酒超標(biāo)率為 5.4%(2/37)，對(duì)照加拿大蒸餾烈酒EC限值(150 μg/L)，保健酒超標(biāo)率為7.1%(2/28)，其它飲料酒均低于限值要求。表2數(shù)據(jù)說(shuō)明黃酒和保健酒中EC含量的平均值和超標(biāo)率較高，其原因跟黃酒、保健酒的釀造與存儲(chǔ)有關(guān)，飲料酒中EC主要來(lái)源是尿素和乙醇反應(yīng)生成，黃酒和保健酒在煎酒過(guò)程中由于工藝需要高溫提高其穩(wěn)定性，造成尿素和乙醇加速反應(yīng)，形成更多EC，同時(shí)保健酒需要長(zhǎng)時(shí)間的浸泡(提取保健材料中的有效成分)、黃酒也需要長(zhǎng)時(shí)間窖藏，使酒液中的尿素和乙醇繼續(xù)反應(yīng)，造成成品中EC含量偏高。

表2 不同發(fā)酵食品中氨基甲酸乙酯污染狀況Table 2 Residue levels of ethyl carbamate in different fermented foods

共監(jiān)測(cè)184批次的調(diào)味品，醬油和醋中EC平均值分別為 84.1 μg/kg、76.2 μg/kg，中位值分別為76.3 μg/kg、52.3 μg/kg，陽(yáng)性率分別為 98.17% 和86.67%，以上數(shù)據(jù)表明醬油和醋中EC的含量高并且檢出率高，需要重點(diǎn)地監(jiān)測(cè)和關(guān)注。共監(jiān)測(cè)29批次的焙烤食品，面包中EC平均值為24.3 μg/kg，中位值為22.2 μg/kg，陽(yáng)性率為72.41%。目前對(duì)飲料酒中EC的形成機(jī)理研究較多，而對(duì)醬油、醋、面包等其它發(fā)酵食品的形成機(jī)理研究非常少，其氨基甲酸乙酯的形成機(jī)理還需要進(jìn)一步研究。

3 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，大部分發(fā)酵食品均存在EC的污染，平均含量最高的是黃酒，其次是醬油和醋，同時(shí)醬油和醋中EC的陽(yáng)性率也相對(duì)較高，在今后的研究和檢測(cè)中需要重點(diǎn)關(guān)注。以上數(shù)據(jù)為我國(guó)發(fā)酵食品中EC的安全性評(píng)估提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)支持。

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