劉俏，龍麗娟

摘要：研究了南海慢原甲藻（Prorocentrum rhathymum）在f/2、f、K、2K、ES、2ES培養(yǎng)基中的生長情況，并對其進行了小白鼠毒性、溶血活性以及腹瀉性貝毒實驗。結(jié)果表明，在溫度25 ℃、鹽度35‰、光照67.5 μmol/（m2·s）、起始密度500 cells/mL條件下，南海慢原甲藻在f培養(yǎng)基中生長最好，細胞密度最大，為7.2×104 cells/mL，生長率也最高，為0.647 division/d。南海慢原甲藻具有溶血活性，單位細胞溶血活性為4.8×10-7 HU/cell。胞內(nèi)和胞外培養(yǎng)液均檢測出腹瀉性貝毒大田軟海綿酸（OA），單位體積胞外OA含量為0.028 1～0.038 4 μg/mL，單位體積胞內(nèi)OA含量穩(wěn)定期最高，為1 690 pg/mL，單位細胞OA含量指數(shù)期最高，為29.0 fg/cell。

關(guān)鍵詞：慢原甲藻（Prorocentrum rhathymum）；培養(yǎng)；生長；毒性

中圖分類號：S968.4 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2013）05-1113-05

Cultivation and Toxicity of Prorocentrum rhathymum from South China Sea

LIU Qiaoa，b，LONG Li-juana

（a. South China Sea Institute of Oceanology / Key Laboratory of Marine Bio-Resourses Sustainable Utilization / Guangdong Key Laboratory of Marine Materia Medica， Guangzhou 510301， China； b. University of Chinese Academy of Sciences， Chinese Academy of Sciences，

Beijing 100049， China）

Abstract： The growth of Prorocentrum rhathymum from South China Sea in f/2 medium， f medium， K medium， 2K medium， ES medium and 2ES medium was studied. The mouse toxicity test， hemolytic assay and DSP test were used to test the toxicity of P. rhathymum. The results showed that when temperature 25 ℃， salinity 35‰， illumination 67.5 μmol/（m2·s）， initial cell density 500 cells/mL， f medium was the best growth condiction for P. rhathymum. The cell density was 7.2×104 cells/mL and the growth rate was 0.647 division/d at those conditions. The hemolytic activity of P. rhathymum was 4.8×10-7 HU/cell. Both intracellular okadaic acid（OA） and extracellular OA in culture medium of P. rhathymum were detected. Extracellular OA content in per volume water was 0.028 1～0.038 4 μg/mL. The maximum intracellular OA content in per volume water was 1 690 pg/mL obtained in stationary phase. The maximum OA content in per cell was 29.0 fg/cell found in exponential phase.

Key words： Prorocentrum rhathymum； cultivation； growth； toxicity

慢原甲藻（Prorocentrum rhathymum）屬于甲藻門（Pyrrophyta）縱裂甲藻綱（Desmophyceae）原甲藻目（Prorocentrales）原甲藻科（Prorocentraceae）原甲藻屬（Prorocentrum Ehrenbeg），是一種具有底棲、附生、浮游三種生活方式的微藻，廣泛分布于地中海[1-3]、太平洋[4-6]、大西洋的熱帶和亞熱帶水域[7]。有研究表明，慢原甲藻可導(dǎo)致牡蠣的消化道細胞脫落以及腸道變寬變薄[8]。2002年5月，澳大利亞新南威爾士的牡蠣大量死亡事件被認為與部分牡蠣攝食慢原甲藻有關(guān)[9]。

慢原甲藻的野生密度低、藻種難獲得，因此關(guān)于慢原甲藻相關(guān)的研究性文獻資料較少。中國科學(xué)院南海海洋研究所海洋活性物質(zhì)及其化學(xué)生態(tài)學(xué)學(xué)科組從我國南海三亞海域分離純化獲得了慢原甲藻藻種，并在實驗室成功進行人工培養(yǎng)，屬國內(nèi)首次記錄[10]。國外已有報道慢原甲藻有小鼠急性毒性、溶血性和腹瀉性貝毒[4，6]。國內(nèi)南海慢原甲藻藻株是否含有毒性以及其生理生態(tài)等方面的研究尚屬空白。本研究通過比較南海慢原甲藻在不同培養(yǎng)基中的生長情況，旨在獲得適宜慢原甲藻生長的培養(yǎng)條件，并對其毒性進行檢測，以期填補國內(nèi)外對南海慢原甲藻研究的空白，為有效利用有毒甲藻資源提供科學(xué)的理論支撐。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

慢原甲藻采自南海三亞海域，由中國科學(xué)院南海海洋研究所海洋活性物質(zhì)及其化學(xué)生態(tài)學(xué)學(xué)科組分離純化得到藻種純系，保存于中國科學(xué)院南海海洋研究所廣東省海洋藥物重點實驗室藻種室。藻種保存條件為溫度25 ℃、鹽度35‰、光照94.5 μmol/（m2·s）、pH 8.0、光暗周期13 h∶11 h、培養(yǎng)基為f/2培養(yǎng)液。

1.2 實驗方法

1.2.1 不同培養(yǎng)基對慢原甲藻生長的影響 研究f/2、f、K、2K、ES、2ES培養(yǎng)基對慢原甲藻生長的影響。實驗條件為溫度25 ℃、鹽度35‰、光照67.5 μmol/（m2·s）、pH 8.0、光暗周期13 h∶11 h、起始密度500 cells/mL。f/2、K、ES培養(yǎng)基的配方參照文獻[11-13]。f、2K、2ES培養(yǎng)基的營養(yǎng)鹽濃度分別是f/2、K、ES培養(yǎng)基的2倍。

每天早上9∶00取樣100 μL，加入1%甲醛固定。將藻液充分混勻后吸取10 μL于浮游植物計數(shù)框上，在顯微鏡下計數(shù)。每個樣品重復(fù)計數(shù)3次，取其平均值，通過換算繪制生長曲線。

根據(jù)文獻[14]的單細胞藻種群生長公式，計算得到藻細胞生長率K（division/d）。

K=■

式中，N0為藻細胞的初始密度（cells/mL），Nt為第t天（指數(shù)末期）的藻細胞密度（cells/mL），t表示培養(yǎng)時間（d）。

1.2.2 慢原甲藻胞內(nèi)毒素與胞外毒素的提取 胞內(nèi)毒素的提?。? 000 r/min離心15 min收集慢原甲藻細胞，棄上清后加甲醇，超聲波振蕩破碎15 min，4 000 r/min離心15 min收集藻提取液。重復(fù)上述步驟至藻提取液呈無色。在38 ℃下將藻提取液減壓蒸干，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

胞外毒素的提?。簠⒖紖墙ㄐ繹15]的方法，在已除去藻細胞的慢原甲藻培養(yǎng)液中加入37%鹽酸，調(diào)節(jié)pH至3.0。將酸化處理的培養(yǎng)液置于分液漏斗中，加入二氯甲烷進行萃取。靜置12 h后取下層溶液，38 ℃減壓干燥。用二氯甲烷回溶后存于10 mL樣品管中，吹干，4 ℃冷藏備用。

1.2.3 小白鼠毒性實驗 采用1.2.2中提取胞內(nèi)毒素的方法提取穩(wěn)定期慢原甲藻的胞內(nèi)毒素。用1%吐溫60生理鹽水稀釋胞內(nèi)毒素提取物，使其所含的細胞密度為1.0×106、2.0×106、4.0×106、8.0×106 cells/mL共4個濃度梯度。

將15只體重為（20±2） g的雌性昆明鼠（購于廣東省實驗動物中心）隨機分成5組，每組3只。實驗組小白鼠腹腔注射0.5 mL上述四種不同濃度的胞內(nèi)毒素提取物，對照組注射0.5 mL 1%吐溫60生理鹽水，記錄24 h內(nèi)小白鼠的中毒癥狀與存活情況。

1.2.4 溶血實驗 取兔血加入盛有等滲鹽溶液（NaCl 73 mmol/L、檸檬酸鈉42 mmol/L、葡萄糖114 mmol/L）的離心管中，1 000 r/min離心2 min，棄上清，重復(fù)3次后用等滲鹽溶液將血細胞稀釋成濃度為0.5%的兔血紅細胞溶液。

洋地黃皂苷（Digitonin）作為溶血毒素的標準物，配制5.2 μg/mL的洋地黃皂苷水溶液。分別吸取洋地黃皂苷水溶液100、150、200、250、300 μL于5個試管中，并向每個試管中加入600 μL經(jīng)處理的兔血紅細胞溶液，用等滲鹽溶液補足各體系至1 mL，使各試管中洋地黃皂苷的濃度分別為0.52、0.78、1.04、1.30、1.56 μg/mL。將上述標準反應(yīng)體系為1 mL的混合溶液于37 ℃光照培養(yǎng)1 h，1 000 r/min離心2 min后取上清100 μL于96孔板，用Multiskan Ascent酶標儀測定波長450 nm下的溶血吸光度（A）。以洋地黃皂苷水溶液的終濃度為橫坐標，溶血百分數(shù)為縱坐標繪制溶血活性的標準曲線。在標準反應(yīng)體系中加入100 μL含200萬個藻細胞的胞內(nèi)毒素提取物進行溶血透光度測定，實驗重復(fù)3次，陰性對照用等滲鹽溶液處理，陽性對照用水溶液處理，藻細胞胞內(nèi)毒素提取物的溶血百分數(shù)根據(jù)標準曲線可得到。

溶血百分數(shù)=（A樣品-A陰性）/（A陽性-A陰性）×100%

式中，A樣品為樣品處理后的吸光度；A陰性為陰性對照的吸光度；A陽性為陽性對照的吸光度，各吸光度均在450 nm下測定。

1個溶血單位（HU）是在1 mL上述反應(yīng)體系下使50%兔血紅細胞溶血所需毒素的量。

1.2.5 腹瀉性貝毒實驗 分別收獲指數(shù)期、穩(wěn)定期、衰亡期的慢原甲藻50 mL，采用1.2.2中的毒素提取方法得到不同生長階段的胞內(nèi)毒素與胞外毒素的提取物。用美國Aabraxis公司的岡田酸檢測試劑盒測定慢原甲藻胞內(nèi)毒素與胞外毒素中的腹瀉性貝毒大田軟海綿酸（Okadaic acid，OA）。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同培養(yǎng)基對慢原甲藻生長的影響

慢原甲藻在f/2、f、K、2K、ES、2ES六種培養(yǎng)基中的生長情況如圖1所示。慢原甲藻在K和2K培養(yǎng)基中的生長情況均不理想，在K培養(yǎng)基中的生長情況最差。慢原甲藻在2ES培養(yǎng)基中的細胞密度雖然比ES培養(yǎng)基中的大，但其生長率卻比ES培養(yǎng)基中的小。慢原甲藻在f/2、ES、f培養(yǎng)基中的生長率相近。在f培養(yǎng)基中獲得的細胞密度最大，為7.2×104 cells/mL，生長率也最大，為0.647 division/d。因此，6種培養(yǎng)基中f培養(yǎng)基最適宜慢原甲藻生長。

2.2 小白鼠毒性實驗結(jié)果

在實驗觀察的24 h內(nèi)，各實驗組小白鼠均未死亡。小白鼠在注射含400萬個藻細胞的胞內(nèi)毒素提取物后0.5 h出現(xiàn)聚群、閉眼，但1 h后又恢復(fù)了活力。注射含200萬、100萬、50萬個藻細胞的胞內(nèi)毒素提取物的實驗組小白鼠與對照組小白鼠相比，未出現(xiàn)明顯的中毒癥狀。出現(xiàn)上述結(jié)果可能是由于注射劑量不夠高或是南海慢原甲藻本身毒素含量較低，對小白鼠的毒性不強，導(dǎo)致高劑量組小白鼠的中毒反應(yīng)不明顯。

2.3 溶血活性實驗結(jié)果

圖2為溶血活性實驗的標準曲線，標準曲線的回歸方程為y=0.196 6 x+0.033 1（r2=0.982 5）。根據(jù)標準曲線的回歸方程計算得到，當(dāng)洋地黃皂苷濃度為1.07 μg/mL時可使兔血紅細胞溶血50%，即1 HU相當(dāng)于1.07 μg/mL的洋地黃皂苷。南海慢原甲藻含200萬個藻細胞的胞內(nèi)毒素提取物可使兔血紅細胞溶血48.1%， 換算得單位細胞溶血活性為4.81×10-7 HU/cell。

2.4 腹瀉性貝毒實驗結(jié)果

圖3為慢原甲藻指數(shù)期、穩(wěn)定期、衰亡期的單位體積胞外OA含量和單位體積胞內(nèi)OA含量。在不同生長階段，慢原甲藻單位體積胞內(nèi)OA含量為0.679 0～1.690 0 μg/mL，單位體積胞外OA含量為0.028 1～0.038 4 μg/mL，單位體積胞內(nèi)OA含量是單位體積胞外OA含量的24～44倍。慢原甲藻各生長階段單位體積胞外OA總量與單位體積胞內(nèi)OA總量的變化趨勢一致，兩者OA含量均在穩(wěn)定期最大，衰亡期最小。

慢原甲藻不同生長階段的單位細胞OA含量與單位體積胞內(nèi)OA含量如圖4所示。由圖4可知，慢原甲藻在指數(shù)期、穩(wěn)定期、衰亡期的單位細胞OA含量存在差別，含量范圍是21.3～29.0 fg/cell，指數(shù)期時含量最高，為29.0 fg/cell，由此推測OA的產(chǎn)生與細胞自身的生長繁殖活動有關(guān)。單位體積胞內(nèi)OA含量與細胞密度呈正相關(guān)關(guān)系，因此在細胞密度最高的穩(wěn)定期達到最大，此時單位體積胞內(nèi)OA含量為1 690 pg/mL，且與指數(shù)期、衰亡期時的含量有顯著差異。

3 小結(jié)與討論

有研究報道，慢原甲藻可以在f/2、K、ES等培養(yǎng)基中生長[6，16，17]，但尚未有文獻報道何種培養(yǎng)基更適合其生長。本研究結(jié)果表明，慢原甲藻在f培養(yǎng)基中不但生長率高達0.647 division/d，而且其細胞密度最大可達7.2×104 cells/mL，是文獻記錄的2倍[18]，說明通過培養(yǎng)基的優(yōu)化選擇可顯著提高藻的產(chǎn)量。

不同地理品系的有毒甲藻藻株毒性差異較大。本研究所用的南海慢原甲藻與澳大利亞新南威爾士的慢原甲藻對小白鼠的毒性結(jié)果不同。新南威爾士株含180萬個藻細胞的甲醇提取物能使實驗鼠在20 min內(nèi)死亡[8]，但南海株含400萬個藻細胞的胞內(nèi)毒素提取物對小白鼠也沒有明顯的毒性作用。說明南海慢原甲藻對小白鼠的毒性不強。本研究結(jié)果與日本沖繩島的慢原甲藻實驗結(jié)果相似[6，8]。

Nakajima等[6]研究表明慢原甲藻有溶血性，本研究與其結(jié)果相同。南海慢原甲藻的單位細胞溶血活性為4.81×10-7 HU/cell，比球形棕囊藻（Phaeocystis globosa）的溶血活性9.26×10-9 HU/cell高2個數(shù)量級[19]。南?？耸锨皽显澹ˋmphidinium klebsii）穩(wěn)定期粗提物的正丁醇部位溶血活性為3.14×10-7 HU/cell，乙酸乙酯部位的溶血活性為2.42×10-6～3.45×10-6 HU/cell[20]，表明藻提取液中不同極性部位的溶血活性大小可能不同，在以后的研究中可進一步探索慢原甲藻不同組分的溶血活性，以確認其溶血物質(zhì)。

不同地理品系的同種藻其毒素含量存在差別。An等[21]在佛羅里達采集的五株慢原甲藻，只有一株被證明含有OA，說明并不是所有的慢原甲藻藻株都含有OA。Caillaud等[4]估計馬來西亞的慢原甲藻單位細胞OA含量為2.9 fg/cell，是本研究慢原甲藻南海株單位細胞OA含量（21.3～29.0 fg/cell）的1/10。藻細胞胞內(nèi)毒素含量與胞外毒素含量一般有顯著差異。網(wǎng)狀原角管藻（Protocetatium reticulatum）穩(wěn)定期胞內(nèi)毒素含量約是胞外毒素含量的2倍[22]。本研究中慢原甲藻單位體積胞內(nèi)OA含量是胞外OA含量的24～44倍，說明慢原甲藻的腹瀉性貝毒主要產(chǎn)于細胞內(nèi)，很少分泌到胞外。慢原甲藻佛羅里達株的單位體積胞外OA含量為0.153 μg/L[21]，本研究中南海株單位體積胞外OA含量達28～38 μg/L。分析其原因，一方面可能是由于檢測方法不同所致，本研究中OA含量測定采用的是試劑盒免疫檢測法，而An等[21]的研究使用的是HPLC-熒光檢測聯(lián)用的化學(xué)檢測法；另一方面也可能是由于本研究中的南海慢原甲藻腹瀉性貝毒的毒性更強。

有毒微藻在不同生長時期的產(chǎn)毒情況存在差異。扁甲藻（Pyrodinium bahamense）和亞歷山大藻（Alexandrium catenella）在指數(shù)期毒素含量最大[23，24]。微小原甲藻（Prorocentrum minimum）的毒性在衰亡期時最強[25]。微小亞歷山大藻（Alexandrium minutum）單位細胞毒素含量在指數(shù)期最高，之后隨時間的推移而減少，其單位細胞毒素含量的變化趨勢與本研究結(jié)果一致[26]。塔瑪亞歷山大藻（Alexandrium tamarense）穩(wěn)定期時的單位體積胞內(nèi)毒素含量最高，與其細胞密度在穩(wěn)定期達到最大有關(guān)[27]。慢原甲藻也在細胞密度最大時的穩(wěn)定期獲得最大的單位體積胞內(nèi)OA含量，表明細胞密度是影響水體總毒性的重要因素之一。

對有毒甲藻的研究一直存在室內(nèi)培養(yǎng)困難的問題，嚴重影響了對其進行全面系統(tǒng)深入的研究。本研究通過培養(yǎng)基的選擇實驗，明確了f培養(yǎng)基最適宜南海慢原甲藻生長，將室內(nèi)培養(yǎng)記錄的細胞密度提高了1倍，為進一步探討慢原甲藻的培養(yǎng)條件獲得了充足的研究材料。本研究確定了我國南海慢原甲藻藻株具有溶血活性和腹瀉性貝毒，鑒于甲藻毒素存在結(jié)構(gòu)新穎的物質(zhì)，是潛在的新藥開發(fā)資源，因此，在提高慢原甲藻產(chǎn)量的基礎(chǔ)上，充分利用南海慢原甲藻的藻種資源，對其開展全面系統(tǒng)深入的毒素成分分析研究是今后慢原甲藻研究的重要方向。

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