朱曦 董文婷 胡深 梁利妺

摘要：針對(duì)《進(jìn)口獸藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》1999年版收錄的恩拉霉素預(yù)混劑含量測定方法中部分檢測條件進(jìn)行了適當(dāng)?shù)母倪M(jìn)，將pH 4.0醋酸鹽緩沖液改為pH 7.8的磷酸鹽緩沖液，檢驗(yàn)用菌株改為金黃色葡萄球菌，培養(yǎng)基改為Ⅱ號(hào)pH 7.8的培養(yǎng)基，終濃度由10～40 U/mL改為100～400 U/mL，由振搖30 min改為超聲提取90 min。優(yōu)化了檢驗(yàn)條件，使檢驗(yàn)結(jié)果更精準(zhǔn)可靠。

關(guān)鍵詞：恩拉霉素；效價(jià)測定；微生物檢定法

中圖分類號(hào)：S859.79+6 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：B 文章編號(hào)：1007-273X（2013）06-0015-02

恩拉霉素（Enramycin）是由放線菌（Streptomyces fungicidicus）發(fā)酵而得，其包括13個(gè)不同種類的17個(gè)氨基酸分子和脂肪酸分子所組成的有機(jī)堿。其中氨基酸分子構(gòu)成環(huán)狀多肽結(jié)構(gòu)，脂肪酸位于多肽結(jié)構(gòu)末端，據(jù)其末端脂肪酸種類不同，分為恩拉霉素 A（C107H138Cl2N26O31）和恩拉霉素B（C108H140Cl2N26O31）。恩拉霉素對(duì)革蘭氏陽性菌有很強(qiáng)的抑制作用，如梭狀芽孢桿菌、鏈球菌、葡萄球菌、肺炎雙球菌等革蘭氏陽性菌均具有很強(qiáng)的抑制作用。尤其是對(duì)梭狀芽孢桿菌（Clostridium）作用更加顯著。恩拉霉素不同于其他抗生素的是長期使用后不容易產(chǎn)生耐藥性，并能促進(jìn)豬、雞增重和提高飼料轉(zhuǎn)化率。

目前國內(nèi)獸藥恩拉霉素含量測定方法的依據(jù)為中國農(nóng)業(yè)部發(fā)布的1999年版《進(jìn)口獸藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》。依據(jù)恩拉霉素的藥理學(xué)特點(diǎn)，在實(shí)際檢測工作中對(duì)樣品提取、緩沖液及終濃度等檢測條件進(jìn)行優(yōu)化，建立新的檢測方法，使得檢測條件更合理，結(jié)果更精準(zhǔn)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

（1）試劑及培養(yǎng)基。冰醋酸、醋酸鈉、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、丙酮、鹽酸等試劑均為分析純。試驗(yàn)用水為蒸餾水。pH 4.0醋酸鹽緩沖液按照1999年版《進(jìn)口獸藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》提供方法配制[1]，pH 7.8的磷酸鹽緩沖液按照2010版的《中國獸藥典》一部附錄抗生素微生物檢定法配制[2]?？股貦z定培養(yǎng)基Ⅰ號(hào)pH 7.8、Ⅱ號(hào)pH 7.8均購于北京海淀中海動(dòng)物保健科技公司。

（2）菌種及標(biāo)準(zhǔn)品?？莶菅挎邨U菌[CMCC（B）63501]，金黃色葡萄球菌[CMCC（B）26003]來源于中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。標(biāo)準(zhǔn)品由武漢興鼎生物科技公司提供，標(biāo)示效價(jià)為1 216 U/mg。

（3）樣品4%的恩拉霉素預(yù)混劑由興鼎生物科技公司提供。

（4）儀器設(shè)備。TOMY ES310高壓滅菌器，干燥箱，恒溫水浴培養(yǎng)箱，ZY-300IV多功能微生物自動(dòng)測量分析儀，移液槍（最大量程1 000 μL）。

1.2 試驗(yàn)方法

（1）按文獻(xiàn)[2]分別制備pH 7.8培養(yǎng)基Ⅰ鋪加枯草芽孢桿菌[CMCC（B）63501]菌懸液和pH 7.8培養(yǎng)基Ⅱ鋪加金黃色葡萄球菌[CMCC（B）26003]菌懸液的雙碟備用。

（2）精密稱取標(biāo)準(zhǔn)品適量，按文獻(xiàn)[1]加提取液（丙酮：1mol/l鹽酸：水 =35：12：56），制成含1 000 U/mL的備用液，再分別用pH4.0的緩沖液與pH 7.8的磷酸緩沖液制成濃度分別為10、40 U/mL與 100、400 U/mL的兩組高低劑量溶液備用。取制備好的1.2（1）中兩種雙碟，分別滴加這兩組高低劑量的溶液，同時(shí)滴加上述兩種緩沖液做空白對(duì)照，（37±1）℃培養(yǎng)。

（3）按文獻(xiàn)[1]取本品適量，精密稱定樣品2.500 0 g，加提取液（丙酮：1mol/l鹽酸：水 =35：12：56），制成含恩拉霉素1 000 U/mL的溶液，充分振搖30 min，取上清液，用醋酸鹽緩沖液（pH4.0）稀釋成終濃度分別為10 U/mL和40 U/mL的溶液；按文獻(xiàn)[2]測定3批樣品的含量。

（4）精密稱定樣品2.500 0 g，加提取液（丙酮：1 mol/l鹽酸：水=35：12：56）約80 mL，水浴超聲40 min，冷至室溫，加提取液制成含恩拉霉素1 000 U/mL的溶液，用磷酸鹽緩沖液（pH 7.8） 稀釋成終濃度分別為10、40 U/mL與100、400 U/mL的兩組溶液；菌懸液菌株為金黃色葡萄球菌〔CMCC（B）26003〕，培養(yǎng)基為Ⅱ號(hào)pH7.8，其他檢測條件不變，按文獻(xiàn)[2]方法測定3批樣品的含量。

（5）在1.2（4）基礎(chǔ)上將樣品超聲提取時(shí)間分別設(shè)定為10 、20 、40 、60 、90 min，終濃度為100和400 U/mL的溶液，其他檢測條件不變，按文獻(xiàn)[2]方法測定3批樣品的含量。

2 結(jié)果與分析

（1）按文獻(xiàn)[1]所載方法，在pH7.8培養(yǎng)基Ⅰ鋪加枯草芽孢桿菌菌懸液的雙碟上滴加醋酸鹽緩沖液（pH 4.0）做為試驗(yàn)空白對(duì)照，培養(yǎng)結(jié)果產(chǎn)生明顯的抑菌圈。滴加的標(biāo)準(zhǔn)溶液高、低濃度形成的抑菌圈平均差值小于1，劑間差異不明顯。按改進(jìn)方法的pH 7.8培養(yǎng)基Ⅱ鋪加金黃色葡萄球菌[CMCC（B）26003]菌懸液的雙碟上滴加pH 7.8的磷酸緩沖液為空白的雙碟，培養(yǎng)結(jié)果無抑菌圈。劑間高低濃度為10 U/mL和40 U/mL的溶液形成的抑菌圈與文獻(xiàn)[1]方法相比稍好，但大小抑菌圈平均差值小于1。劑間濃度為100 U/mL和400 U/mL的溶液形成的抑菌圈大小圈差值大于2且小于3.5，劑間差異較明顯（表1）。

（2）按文獻(xiàn)[1]和改進(jìn)方法測樣品含量，由表2可見，文獻(xiàn)[1]所載方法由于劑間差異不顯著，所得抑菌圈數(shù)據(jù)不符合獸藥檢驗(yàn)操作規(guī)程，檢測結(jié)果無效。方法改進(jìn)后可得到較為準(zhǔn)確的檢驗(yàn)結(jié)果。

（3）方法改進(jìn)后，所使用的超聲提取時(shí)間對(duì)結(jié)果的影響見表3。由表3可見，劑間濃度為100 U/mL和400 U/mL，經(jīng)過超聲提取，超聲時(shí)間對(duì)檢測結(jié)果也有一定的影響，超聲提取時(shí)間在10～40 min期間，超聲時(shí)間越長檢測結(jié)果越高，說明延長超聲時(shí)間可以充分提取樣品。但超聲時(shí)間超過40 min后特別是到90 min時(shí)，提取結(jié)果反而下降，說明超聲40 min就可完全提取樣品。

3 討論

（1）原方法中所用醋酸鹽緩沖液（pH 4.0）在一定程度上抑制方法中枯草芽孢桿菌的生長，使得空白醋酸鹽緩沖液（pH 4.0）也能產(chǎn)生抑菌圈。而抗生素微生物檢定管碟法的原理是在鋪加一定量菌懸液的瓊脂平板上，利用抗生素在瓊脂培養(yǎng)基內(nèi)的擴(kuò)散作用，比較標(biāo)準(zhǔn)品與供試品兩者對(duì)接種的試驗(yàn)菌產(chǎn)生抑菌圈的大小，以測定供試品效價(jià)的一種方法。由于抑菌圈的大小與檢測結(jié)果相關(guān)，本法所用的稀釋液、緩沖液不能有抑菌或殺滅病菌的作用。而文獻(xiàn)[1]所載檢測方法使用的醋酸鹽緩沖液（pH4.0）影響了恩拉霉素正常的抑菌圈的大小，掩蓋了其真實(shí)的抑菌作用，使檢測結(jié)果有誤 ，此方法不適用于檢測恩拉霉素的效價(jià)。而改進(jìn)后的方法避免了此類問題，所用菌株對(duì)恩（下轉(zhuǎn)第 21 頁）

（上接第 16 頁）

拉霉素敏感，緩沖液對(duì)菌株無抑制或殺滅作用。

（2）文獻(xiàn)[1]所載檢測方法中振搖提取30 min，在實(shí)際檢測中發(fā)現(xiàn)超聲更利于提取，且超聲時(shí)間對(duì)其結(jié)果有一定的影響，在超聲40 min時(shí)就可完全提取主藥成分，因此采用超聲提取要比振搖更能得到真實(shí)準(zhǔn)確的檢測結(jié)果。

（3）文獻(xiàn)[1]所載檢測方法，上碟濃度范圍為10 U/mL和40 U/mL。改進(jìn)后的方法上碟濃度范圍改為100 U/mL和400 U/mL，用原方法檢測發(fā)現(xiàn)使用該濃度范圍，即使加菌量減小所形成的抑菌圈依然偏小，達(dá)不到文獻(xiàn)[2]規(guī)定的標(biāo)準(zhǔn)品高濃度抑菌圈直徑范圍應(yīng)在18～22 mm的要求，影響結(jié)果的準(zhǔn)確性。而改進(jìn)后標(biāo)準(zhǔn)品高濃度抑菌圈直徑范圍在18～22 mm之間，且大小圈差異明顯，符合文獻(xiàn)[2]要求，使得檢測結(jié)果更精準(zhǔn)。

參考文獻(xiàn)：

[1] 中華人民共和國農(nóng)業(yè)部《進(jìn)口獸藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》（1999年版）[S].

[2] 中國獸藥典委員會(huì).中華人民共和國獸藥典（2010年版一部）[M].北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2011.