趙旭輝　門興元　周成剛

摘要：刺吸電位技術(shù)（electrical penetration graph，簡(jiǎn)稱EPG）是昆蟲電生理學(xué)發(fā)展的技術(shù)之一，主要用于研究刺吸式口器昆蟲對(duì)寄主植物的取食行為。通過(guò)電子轉(zhuǎn)換，將刺吸式昆蟲取食行為中的不同階段以不同的取食波形顯示出來(lái)。本文綜述了刺吸電位技術(shù)的發(fā)展歷史、工作原理和植食性盲蝽的取食特點(diǎn)以及不同盲蝽取食行為中的EPG波形變化，同時(shí)概述了EPG應(yīng)用中的技術(shù)要點(diǎn)。

關(guān)鍵詞：EPG；植食性盲蝽；取食行為；EPG波形

中圖分類號(hào)：S431.9文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A文章編號(hào)：1001-4942（2013）07-0133-05

電信號(hào)傳遞是生物體內(nèi)信息傳遞的主要方式之一^[1]，對(duì)電信號(hào)的研究衍生出了電生理學(xué)。作為昆蟲電生理學(xué)研究的常用技術(shù)之一，刺吸電位技術(shù)（electrical penetration graph， EPG）通過(guò)記錄刺吸式口器昆蟲口針在寄主組織中的刺探行為引起的電信號(hào)變化特征來(lái)對(duì)昆蟲口針在寄主組織中的位置進(jìn)行準(zhǔn)確定位，從而對(duì)刺吸式昆蟲取食行為的不同階段進(jìn)行研究。經(jīng)過(guò)不斷的發(fā)展，EPG技術(shù)已經(jīng)成為研究刺吸式口器昆蟲對(duì)寄主植物的取食選擇性、取食部位蟲傳病毒的機(jī)制和作物的抗蟲機(jī)制等的重要手段^[2～5]。

EPG技術(shù)最先應(yīng)用于蚜蟲取食行為的研究，此后逐漸應(yīng)用在粉虱和葉蟬等典型刺吸式昆蟲的取食行為研究中。近年來(lái)，由于植食性盲蝽類害蟲的大面積暴發(fā)，EPG技術(shù)在植食性盲蝽類害蟲取食行為研究中的應(yīng)用日益增加。在植食性的刺吸類害蟲中，植食性盲蝽類昆蟲屬于細(xì)胞取食者，其取食行為特點(diǎn)與蚜蟲和粉虱等汁液取食者有所不同，因而這兩類昆蟲取食行為的EPG波形有一定的差別，在EPG使用中的技術(shù)要點(diǎn)上也有一些差異。目前EPG技術(shù)在植食性盲蝽取食行為研究中的應(yīng)用尚有較大空間。

1EPG的發(fā)展歷史及其工作原理

1.1EPG的發(fā)展歷史

EPG的原型是1964年美國(guó)加利福尼亞大學(xué)McLean和Kinsey設(shè)計(jì)的蚜蟲取食監(jiān)測(cè)系統(tǒng)（electrical feeding monitor），并依此建立了蚜蟲的取食和分泌唾液的波形記錄，及豌豆蚜取食刺吸行為與電子記錄波形的對(duì)應(yīng)關(guān)系，后來(lái)又觀察了溫度對(duì)刺吸行為的影響^[6～9]。之后歷經(jīng)不少學(xué)者的努力改進(jìn)，最終得以發(fā)展成熟^[10～16]。到了20世紀(jì)80年代中期，EPG技術(shù)與計(jì)算機(jī)聯(lián)用，明顯提高了分析效率，之后的絕大多數(shù)EPG 的使用逐步建立在波形基礎(chǔ)上，對(duì)昆蟲行為生態(tài)學(xué)進(jìn)行研究，研究對(duì)象也擴(kuò)展到包括粉虱、葉蟬、薊馬等在內(nèi)的多種刺吸式昆蟲^[17]。而研究方法也逐步的由單純的EPG系統(tǒng)向著EPG系統(tǒng)與影像監(jiān)測(cè)技術(shù)、顯微技術(shù)以及熒光技術(shù)聯(lián)合使用的方向轉(zhuǎn)化，這無(wú)疑會(huì)使研究更加細(xì)致和深入。

1.2EPG的工作原理

在EPG整個(gè)回路中，用水溶性銀膠將一根長(zhǎng)2～3 cm、直徑10～20 μm的金線（或鉑金線）的末端粘在昆蟲的前胸背板上^[14]，以此作為昆蟲電極；將一根長(zhǎng)約10 cm，直徑約2 mm的銅棒插入到濕潤(rùn)的土壤中作為植物電極。當(dāng)刺吸式昆蟲口針插入到植物組織中時(shí)，整個(gè)回路接通，此時(shí)用放大器將回路電流輸出成為一系列的輸出電流波譜，將刺吸式昆蟲的取食過(guò)程通過(guò)電位的形式記錄下來(lái)^{[11～13，18]}。

EPG的電勢(shì)波動(dòng)分為電阻（R）成分和電動(dòng)勢(shì)（emf）成分。前者由電阻變化引起，后者由生物電生理變化引起。當(dāng)放大器的輸入電壓改變時(shí)，極性和幅度會(huì)隨之改變的為R成分，保持不變的為emf成分^{[11～13，18]}。如果整個(gè)系統(tǒng)的設(shè)計(jì)是基于交流電路，則稱其為 AC-EPG，即交流電型電子取食監(jiān)測(cè)儀。AC-EPG的R成分和emf 成分的變換都可引起輸出電壓的變化，目前在美國(guó)應(yīng)用較多。若系統(tǒng)用一個(gè)不可轉(zhuǎn)換的沒(méi)有矯正器或過(guò)濾器的中至高輸入電阻（109～1012 Ω）的放大器或使用干電池則為直流電型電子取食監(jiān)測(cè)儀（DC-EPG）^{[11，19～21]}，目前歐洲應(yīng)用較多。DC-EPG系統(tǒng)的R成分固定，輸出電壓的變化僅為emf成分，這顯然使輸出的波形更加準(zhǔn)確和細(xì)致^[17]。

2植食性盲蝽的取食特點(diǎn)

植食性盲蝽為刺吸式口器昆蟲，但此類昆蟲屬于細(xì)胞取食者（mesophyll feeder），其取食方式和蚜蟲、粉虱等汁液取食者（vascular feeder）有所不同^[22]。植食性盲蝽主要取食植物細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核，在取食時(shí)先將口針插入植物細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞間，然后通過(guò)口針的劇烈活動(dòng)撕碎植物細(xì)胞，在破壞細(xì)胞的同時(shí)分泌唾液，將要取食的食物變成泥漿狀物質(zhì)之后再進(jìn)行吸食^[23]。此類昆蟲在吸食了這種泥漿狀的物質(zhì)后，在取食部位植物組織內(nèi)留下一個(gè)空洞，造成被害植物組織壞死，形成刺點(diǎn)^{[24，25]}。

3植食性盲蝽取食行為中的EPG波形

EPG應(yīng)用于盲蝽研究的時(shí)間較短，目前使用EPG進(jìn)行過(guò)研究的有豆莢草盲蝽^[26]、中黑盲蝽^[27]以及綠盲蝽^[28，29]。

3.1豆莢草盲蝽取食的 EPG波形探究2002 年Cline和Backus首次利用AC-EPG和錄像設(shè)備研究了豆莢草盲蝽在人工飼料上的取食行為，首次對(duì)植食性盲蝽類昆蟲的取食行為進(jìn)行了EPG的研究。他們共對(duì)豆莢草盲蝽取食行為中的7種行為進(jìn)行了EPG波形的定義，并將波形劃分成了8種，分別命名為A波、B波、C1波、C2波、D波、F波、Z1波以及Z2波，之后又首次通過(guò)EPG和錄像設(shè)備對(duì)豆莢草盲蝽的口針刺探穿刺行為和其與刺探行為和非刺探行為相關(guān)的外部身體活動(dòng)進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)學(xué)分析^[30]。

3.2中黑盲蝽取食的 EPG波形探究蔡曉明等（2008）^[27]用DC-EPG記錄中黑盲蝽雌蟲在菜豆、苜蓿、甘藍(lán)、小麥、棉花等寄主上的取食行為，發(fā)現(xiàn)不同寄主植物上的取食波形大致相同。整個(gè)刺探波呈“～”樣的波浪形，大致可分為4部分：Ⅰ波、Ⅱ波、Ⅲ波、Ⅳ波。Ⅰ波表示口針的刺入；Ⅱ波表示口針在撕裂植物組織和細(xì)胞，并分泌唾液；Ⅲ波表示吸食，有Ⅲ1和Ⅲ2兩種表現(xiàn)形式；Ⅳ波表示口針的拔出。此外中黑盲蝽在菜豆、苜蓿上取食的Ⅱ波中鑲嵌有鋸齒狀K波。

3.3綠盲蝽取食的EPG波形探究對(duì)綠盲蝽取食行為的EPG波形定義目前有兩種，如圖1和圖2所示。兩者的研究均以棉花作為寄主植物，但前者是以綠盲蝽4齡若蟲為研究對(duì)象，后者是以綠盲蝽成蟲為研究對(duì)象。所獲得的波形及其定義均以中黑盲蝽取食的EPG波形作為參照且大致相同。

圖1中所示有綠盲蝽取食的5種波形，稱為NP波、A波、M波、H波和B波。 其中NP 波是綠盲蝽口針停留在葉片表面未進(jìn)行刺吸行為的波形；A 波是綠盲蝽以很快速度刺入葉片的波形（0.05～0.2 Hz）； H 波是綠盲蝽刺入組織后，在組織內(nèi)的刺探波形（0.5～1，5～6 Hz）；M 波是口針進(jìn)入韌皮部中破碎細(xì)胞并分泌唾液（0.5～1 Hz）；B波是綠盲蝽在組織內(nèi)部進(jìn)行取食，以及取食完畢后口針拔出（0.5～1、2～3 Hz）。

圖2所示綠盲蝽取食行為的EPG波形與中黑盲蝽取食的EPG波形大體上一致，整個(gè)取食過(guò)程的EPG呈現(xiàn)“～”狀的波浪形并分為Ⅰ波、Ⅱ波、Ⅲ波、Ⅳ波4個(gè)部分。其中Ⅰ波表示綠盲蝽口針開始刺入植物組織；Ⅱ波表示綠盲蝽口針已經(jīng)刺入植物表皮，在撕裂植物組織或細(xì)胞；Ⅲ波表示綠盲蝽在取食細(xì)胞內(nèi)容物；Ⅳ波表示綠盲蝽拔出口針，結(jié)束取食。

4EPG應(yīng)用中的技術(shù)要點(diǎn)

4.1實(shí)驗(yàn)材料的選擇

實(shí)驗(yàn)所選植物應(yīng)長(zhǎng)勢(shì)良好、莖葉健壯，以盡可能的減少由于實(shí)驗(yàn)材料所導(dǎo)致的誤差，葉片的選定要根據(jù)實(shí)驗(yàn)的具體目的來(lái)確定。為防止葉片移動(dòng)造成蟲體脫落，可用斜放的塑膠板或聚酯板固定葉片^[31]。所用昆蟲應(yīng)選用行動(dòng)力強(qiáng)的健康昆蟲，蟲齡的選用依據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康膩?lái)確定，選用成蟲時(shí)一般選用剛剛羽化的，若蟲則選用剛完成蛻皮的。

4.2實(shí)驗(yàn)昆蟲的預(yù)處理

進(jìn)行EPG的實(shí)驗(yàn)前一般需要對(duì)選用的昆蟲進(jìn)行固定以方便昆蟲與金絲的粘連，目前常用的固定方法主要有負(fù)壓法、冷凍法或CO2麻醉法。負(fù)壓固定可采用真空泵或負(fù)壓等制作固定昆蟲的裝置，簡(jiǎn)單的也可以利用水流產(chǎn)生的負(fù)壓。昆蟲的麻醉方法有干冰麻醉法、冷凍法和乙醚麻醉法。目前常用麻醉法與固定法相結(jié)合的方式固定昆蟲，其中麻醉法可選用CO2麻醉法，固定法采用真空泵負(fù)壓法。

4.3實(shí)驗(yàn)昆蟲與金絲的連接

電極與昆蟲蟲體的連接是一個(gè)技術(shù)難點(diǎn)^[32]，即金絲表面比較光滑，橫截面較小，很難聚集銀膠，而試蟲的連接需要一定的接觸面積才能保證其牢固性。在實(shí)踐中，我們可以在金絲端部制作一個(gè)鉤狀結(jié)構(gòu)或者使之形成一個(gè)銀膠球的方式解決上述難點(diǎn)^[31]。將金絲端部浸入銀膠中，抽出后讓附著的銀膠在空氣中干燥 1～2 min，再將金絲端部浸入銀膠，如此反復(fù)至金絲端部形成一個(gè)銀膠球。銀膠球的大小可根據(jù)昆蟲個(gè)體大小進(jìn)行選擇。成蟲和大齡若蟲粘連時(shí)可先將麻醉過(guò)的綠盲蝽腹面用負(fù)壓裝置吸住，然后直接進(jìn)行粘連；低齡若蟲需要在解剖燈下進(jìn)行粘連的操作。

在將綠盲蝽與金絲粘連成功以后可直接與電極連接并開始記錄，但在分析數(shù)據(jù)時(shí)應(yīng)該把記錄開始到開始刺探前的這段時(shí)間去掉，因?yàn)橄群筮B接金絲的昆蟲所受的干擾時(shí)間和程度不同，可能使得在記錄植物上的刺探開始前的適應(yīng)期不同。有學(xué)者認(rèn)為在連好金絲后需要先將昆蟲進(jìn)行饑餓或適應(yīng)處理。

4.4記錄過(guò)程中的問(wèn)題

EPG 對(duì)外界干擾十分敏感，外界電波的干擾會(huì)影響記錄的信號(hào)，所以整個(gè)實(shí)驗(yàn)裝置應(yīng)置于一個(gè)電壓比較穩(wěn)定、免除外界干擾的環(huán)境中，DC-EPG 必須使用接地的法拉第籠來(lái)屏蔽噪音^[33]。在每次實(shí)驗(yàn)前，先要對(duì) EPG 系統(tǒng)和放大系數(shù)進(jìn)行調(diào)校。植物電壓的調(diào)校不當(dāng)會(huì)造成只有正的波形或者只有負(fù)的波形被記錄的情況； 而放大系數(shù)的調(diào)校不當(dāng)會(huì)造成有些有意義的波形不能明確顯示^[34]。放大系數(shù)為 50 倍比較適宜。

EPG 實(shí)驗(yàn)記錄時(shí)間的長(zhǎng)短主要取決于實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹Ｒ话憷ハx與植物關(guān)系的研究需要記錄 6 h。而研究昆蟲傳毒機(jī)制，記錄幾分鐘就可以了。若研究寄主植物表面或葉肉層次物理化學(xué)性質(zhì)對(duì)昆蟲取食行為的影響，一般記錄30 min～3 h 。

另外需要在記錄時(shí)采用EPG通道隨機(jī)排列以及多重復(fù)的方法來(lái)盡可能的消除誤差。

5展望

盡管EPG技術(shù)經(jīng)過(guò)不斷的發(fā)展已經(jīng)比較成熟，但目前研究較為深入的主要是一些汁液取食類的刺吸式昆蟲如蚜蟲、粉虱等。對(duì)植食性盲蝽等細(xì)胞取食者的研究仍然不甚深入，現(xiàn)作出定義的一些盲蝽類昆蟲取食波形都是針對(duì)的一些較為籠統(tǒng)的行為意義；對(duì)盲蝽取食波形的劃分還不夠細(xì)致，且沒(méi)有經(jīng)過(guò)驗(yàn)證；對(duì)一些不規(guī)范波形如突然超出量程的情況尚未發(fā)現(xiàn)出現(xiàn)原因及其行為學(xué)意義，這還需要進(jìn)行更加細(xì)致的研究；同時(shí)在實(shí)驗(yàn)過(guò)程當(dāng)中的一些操作技術(shù)需要進(jìn)一步的規(guī)范。鑒于近年來(lái)植食性盲蝽對(duì)果樹的危害日益嚴(yán)重，EPG技術(shù)用于果樹危害研究的可能性也需要進(jìn)行探究。

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