甘維熊　周輝霞

摘要：鈣蛋白酶是一種重要內(nèi)源性蛋白酶，廣泛存在于肌細胞質(zhì)中，它在Ca2+的激活下能降解肌原纖維蛋白，從而改善肉品嫩度。在介紹鈣蛋白酶結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上，闡述了鈣蛋白酶與宰后肌肉嫩度的關(guān)系、嫩化肌肉的機制及其營養(yǎng)調(diào)控。

關(guān)鍵詞：鈣蛋白酶；肌肉嫩度；營養(yǎng)調(diào)控

中圖分類號：S879.2；Q512 文獻標識碼：B 文章編號：1007-273X（2013）08-0072-02

動物肌肉嫩度是消費者區(qū)分肌肉品質(zhì)的重要指標，Savell等[1]報道盡管牛腰大肌的風味和多汁性與其他部位的牛肉相比都較差，但是消費者卻認為牛腰大肌是最有價值的肌肉，因為該肌肉的嫩度最大。Shackelford等[2]報道美國居民為消費嫩度大的肌肉而愿意為此支付額外的費用。通過對宰前或宰后對動物施以營養(yǎng)或非營養(yǎng)手段的處理，以期肌肉的嫩度得以改善。動物宰殺后，肌肉要先后經(jīng)歷老化階段和成熟階段，不同動物宰后肌肉老化的程度都相似，但是嫩化的程度和速率的變異非常大，因此它是影響肌肉成熟后嫩度差異的主要原因[3]。隨著對肉成熟嫩化的機理的深入研究發(fā)現(xiàn)鈣蛋白酶（Calpain）是肌纖維蛋白分解的重要內(nèi)源性酶，鈣蛋白酶的活性與肌肉嫩度直接相關(guān)。

1 鈣蛋白酶結(jié)構(gòu)

肌細胞中的鈣蛋白酶主要分布在Z線和肌漿膜附近的細胞質(zhì)中，根據(jù)鈣蛋白酶表現(xiàn)半最高活性所需的Ca2+ 濃度的不同，可以將普遍存在的鈣蛋白酶分為兩種，一種為μ-Calpain激活所需Ca2+濃度為微摩爾級（1～65 μmol/L），另一種為m-Calpain激活所需Ca2+濃度為毫摩爾級（0.25～1.00 μmol/L）。它們都由2大小個亞基組成，其中28 ku小亞基在2種Calpain中是相同的，是單個基因的產(chǎn)物，而80 ku大亞基則是不同基因的產(chǎn)物，在氨基酸序列上有差異，表現(xiàn)在N末端序列長度和Ca2+結(jié)合區(qū)域的不同，但它們都含有保守的活性位點。μ-Calpain中的大亞基的質(zhì)量稍大于m-Calpain中大亞基的質(zhì)量（81 889 u VS 79 900 u）。μ-Calpain和m-Calpain大亞基都包含有4個結(jié)構(gòu)域，從氨基端到羧基端分別編為結(jié)構(gòu)域Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ。結(jié)構(gòu)域Ⅰ在鈣蛋白酶活化后發(fā)生自溶而活化，而結(jié)構(gòu)域Ⅱ含有催化活性中心，二者是蛋白酶的活性核心區(qū)。

2 宰后肌肉中Calpain活性變化

Veiseth等[4]研究發(fā)現(xiàn)，羊肌肉在宰后24、72 h，μ-Calpain的活性比最初分別下降42%和95%，360 h后則無活性，而宰后貯存對m-Calpain則無影響，但作者用5 mol/L的氯化鈣溶液處理m-Calpain，發(fā)現(xiàn)其發(fā)生了自溶且活性隨時間的延長出現(xiàn)了與μ-calpain相似的消失規(guī)律，因此認為m-Calpain在宰后羊的肌肉細胞中呈無活性狀態(tài)主要是由于鈣離子濃度不能使其發(fā)生自溶。另外，Delgado等[5]研究也發(fā)現(xiàn)普通羊背最長肌中的μ，m-Calpain在宰后的活性變化，發(fā)現(xiàn)μ-Calpain在宰后1、3的活性分別降至宰后的42.6%、19%，而在第10天時已不能檢測到μ-Calpain的酪蛋白的水解活性。m-Calpain在宰后3、10 d則分別降至宰后的86%、76%，而酪蛋白水解活性與沒有變化。鈣蛋白酶活性與動物品種[2]、動物性別[6]、營養(yǎng)水平[7]等因素相關(guān)，因此在不同研究中，各研究者得出的鈣蛋白酶活性變化速率存在差異。

3 Calpain在宰后肌肉嫩化中的作用

3.1 對Costameres的降解

Costameres是存在于肌細胞中的一些絲狀的結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)，起著連接肌原纖維和肌纖維膜、穩(wěn)定肌細胞結(jié)構(gòu)的作用。在骨骼肌肌細胞中，位于肌膜附近的肌原纖維在每Ⅰ帶水平上都有costameres結(jié)構(gòu)。它主要由vinculin、desmin和dystrophin組成[8]。

Thompson等[9]用體內(nèi)法和體內(nèi)法同時研究發(fā)現(xiàn)costameres是Calpains的良好底物。Taylor等[10]通過電鏡發(fā)現(xiàn)，在4 ℃下存放的牛股二頭肌（BF）和半膜?。⊿M）的肌纖維中，Costameres在24 h內(nèi)部分已被破壞，72 h則完全被破壞，蛋白質(zhì)印跡分析也證實了Costameres的兩種重要蛋白desmin和vinculin幾乎完全降解，而此時正是肌肉嫩化的主要時期，因此認為肌肉早期嫩化與costameres的降解高度相關(guān)。Costmeres的主要作用是使肌細胞膜與肌纖維聯(lián)系在一起，Taylor等[11]發(fā)現(xiàn)牛肌細胞膜在宰后24 h由0 h時的內(nèi)陷狀態(tài)復(fù)原，二者相互分離表明Costameres在24 h內(nèi)已經(jīng)開始被Calpains降解，所有肌細胞中Costameres連接作用的完全消失是在宰后72 h內(nèi)，因此表明宰后肌肉Costameres降解的時間主要是宰后24～72 h。Hwan等[12]利用蛋白印跡技術(shù)檢測牛半腱肌在宰后嫩化過程中肌纖維蛋白降解的試驗中也發(fā)現(xiàn)desmin宰后的降解，但是其降解時間是發(fā)生在宰后72 h與Taylor等[11]的24～72 h有差異，造成不一致的可能原因是試驗肌肉不同。即半膜肌中的desmin降解速率快于股二頭肌中的desmin降解速率。

3.2 對N2線和肌原纖維間desmin和M-filaments的降解

N2線主要由nebulin和titin組成，二者都穿過Ⅰ區(qū)并將N端和C端分別固定于Z線上，N2線的作用是聯(lián)系肌纖維內(nèi)粗肌絲和細肌絲。而肌原纖維間desmin和M-filaments也是維持肌細胞結(jié)構(gòu)完整而必需的結(jié)構(gòu)蛋白。

Goll[13]通過對肌纖維顯微結(jié)構(gòu)的觀察發(fā)現(xiàn)N2線在宰后冷儲中，首先被降解，由于N2線固定于Z線，因此在于Z線附近也發(fā)現(xiàn)有裂縫；作者發(fā)現(xiàn)肌細胞中的另一個超微結(jié)構(gòu)的改變是在肌細胞內(nèi)相鄰肌原纖維彼此分離呈游離狀態(tài)。在正常情況下，相鄰肌細胞靠處于Z線的demin和處于M線的M-filaments 連接，因此推測宰后肌肉嫩化過程中相鄰肌細胞間desmin和M-filaments被calpain降解。Taylor等[11]通過蛋白印跡技術(shù)分析在宰后肌肉儲存過程中，發(fā)現(xiàn)在宰后24 h內(nèi)已大約有25%的骨骼肌nebulin降解，而titin在0 h已開始降解，但主要的降解時期是宰后24～72 h，它由T1型降解為較小分子量的T2型，因此宰后肌肉中titin和nebulin的降解與肌肉的早期嫩化顯著相關(guān)。

4 動物營養(yǎng)對Calpain活性的調(diào)控

肌肉生長速率的加快是肌肉蛋白質(zhì)周轉(zhuǎn)加快的表現(xiàn)，而蛋白質(zhì)周轉(zhuǎn)是肌纖維蛋白降解和沉積的比值，其中的肌纖維蛋白的降解是受calpain嚴格調(diào)控的。因此，在宰前通過營養(yǎng)調(diào)控肌肉沉積速率進而調(diào)節(jié)了肌細胞中的calpain量，以便為宰后肌肉的嫩度提高提供新的途徑。

4.1 飼喂制度

Kristensen等[14]研究由四種不同飼喂制度而造成不同生長速率的豬，在宰后calpain的活性及肌肉的嫩度的變化。在28d-90d-165d試驗期間，四種不同飼喂方式分別為全程自由采食（AA），全程限飼（ RR），前期自由采食后期限飼（AR）和前期限飼而后期則自由采食（RA）。通過測定μ-Calpain、m-Calpain及宰后肌肉1、4 d的剪切力發(fā)現(xiàn)在生長后期出現(xiàn)了明顯的補償生長的RA處理組的豬μ-Calpain、m-Calpain的活性與AA組的豬無差異，但這兩個處理的豬Calpain活性都高于RR和AR處理組。

4.2 營養(yǎng)水平

唐仁勇等[7]報道宰前添加天冬氨酸鎂對豬μ-Calpain mRNA含量的影響，發(fā)現(xiàn)宰前9 d添加天冬氨酸鎂能提高μ-Calpain mRNA的表達量，改善了宰后豬背最長肌24 h的嫩度，而張勇等[15]研究了日糧不同蛋白質(zhì)水平對豬骨骼肌鈣蛋白酶基因表達及嫩度的影響，結(jié)果表明日糧不同蛋白質(zhì)水平對μ-Calpain mRNA在骨骼肌中的表達量有顯著影響（P<0.01），其表達量隨日糧蛋白質(zhì)水平的升高而下降，致使肌肉嫩度降低。

參考文獻：

[1] SAVELL JW， SHACKELFORD S D. Significance of tenderness to the meat industry[J]. Proc Recip Meat Conf， 1992（45）：43-46.

[2] SHACKELFORD S D， WHEELER T L， Meade M K. Consumer impressions of Tender Select beef[J]. Anim Sci，2001（79）：2605-2614.

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[4] VEISETH E， SHACKELFORD S D， WHEELER T L. Effect of postmortem storage on mu-calpain and m-calpain in ovine skeletal muscle[J]. Anim Sci，2001，（79）：1502-1508.

[5] DELGADO E F， GEESINK G H， MARCHELLO， et al. Properties of myofibril bound calpain activity in longissimus muscle of callipyge and normal sheep[J].Anim Sci，2001（79）：2097-2107.

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[7] 唐仁勇，陳代文，張克英，等. 宰前短期添加天冬氨酸鎂和維生素D3對育肥豬肉品質(zhì)及μ-Calpain與Calpastatin基因表達的影響[J].中國畜牧雜志， 2008，4428-31.