陳艷

摘 要：文章通過(guò)初步觀察大腸癌患者癌組織與正常成人腸黏膜蛋白質(zhì)的差異表達(dá)，為進(jìn)一步探討大腸的分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)。應(yīng)用蛋白質(zhì)組學(xué)的雙向電泳技術(shù)，對(duì)大腸癌患者與正常成人腸黏膜蛋白質(zhì)表達(dá)進(jìn)行比較，觀察其差異點(diǎn)。得到分辨率和重復(fù)性均好的大腸癌患者與正常成人直腸黏膜蛋白的雙向凝膠電泳圖譜，發(fā)現(xiàn)二者之間在表達(dá)上有明顯差異，差異表達(dá)蛋白質(zhì)點(diǎn)數(shù)共26個(gè)差異點(diǎn)，其中在大腸癌組織中表達(dá)上調(diào)點(diǎn)11個(gè)，下調(diào)的點(diǎn)15個(gè)。共分析了10個(gè)差異蛋白點(diǎn)，在10個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)中有5個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)得到鑒定。結(jié)論是大腸癌原發(fā)灶和正常腸黏膜蛋白質(zhì)組表達(dá)有顯著差異，HSP27蛋白、S100A9蛋白和GST-π蛋白表達(dá)上調(diào)，GRP75蛋白表達(dá)下調(diào)有可能與大腸癌發(fā)生相關(guān)。

關(guān)鍵詞： 大腸癌 蛋白質(zhì)組學(xué) 差異表達(dá)

大腸癌是我國(guó)常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，近年來(lái)發(fā)病率呈上升趨勢(shì)，尤其是結(jié)腸癌發(fā)病率的增長(zhǎng)速度迅猛。全球大腸癌的發(fā)病率在腫瘤中男性居第4位、女性居第3位，患病率居第2位[1]。早期發(fā)現(xiàn)、早期診斷、早期治療是決定大腸癌患者預(yù)后及生活質(zhì)量的關(guān)鍵。為了深入研究大腸癌發(fā)生、發(fā)展的分子機(jī)制，強(qiáng)化大腸癌的防治效果，筆者采用蛋白質(zhì)組學(xué)雙向凝膠電泳（2-DE）等研究方法，對(duì)比分析正常直腸黏膜、大腸癌原發(fā)灶組織中蛋白質(zhì)的表達(dá)差異，分離、鑒定大腸癌發(fā)生的相關(guān)蛋白，研究其對(duì)大腸癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響，以期為篩選臨床腫瘤標(biāo)志物和治療靶標(biāo)提供依據(jù)。

1.材料與方法

1.1材料

1.1.1標(biāo)本采集。實(shí)驗(yàn)所用標(biāo)本均取自湖南中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院，國(guó)家重點(diǎn)肛腸科經(jīng)病理確診的本病首診患者共10例，以及經(jīng)病理確診的正常成人直腸黏膜12例。

1.1.2試劑。IPG緩沖液pH3～10、24cm固相化pH梯度干膠條、2D Quant蛋白質(zhì)定量試劑盒、考馬斯亮藍(lán)G-250，購(gòu)自Amershan Pharmacia公司。

1.1.3儀器。IPGphor等電聚焦儀、Ettan DALT Ⅱ垂直電泳槽、Imagescanner掃描儀均為Amersham Biosciences公司產(chǎn)品。

1.2方法

1.2.1組織蛋白樣品的制備。組織活檢樣本用生理鹽水反復(fù)沖洗，以去除血液及其他污染，稱取適量組織樣品與8倍體積的組織裂解液混合后，用研缽使組織充分研磨裂解，研磨過(guò)程中不斷加入液氮以避免蛋白降解，置于室溫下1小時(shí)，間斷渦旋混勻，然后于12000g、4℃離心1小時(shí)，吸取上清液即為組織的總蛋白質(zhì)。2D Quant Kit定量試劑盒測(cè)定蛋白濃度。

1.2.2二維凝膠電泳。操作步驟主要按照IPGphor等電聚焦系統(tǒng)使用指南進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.3凝膠圖像分析。應(yīng)用Imagescanner掃描儀及LabScan掃描軟件掃描考馬斯亮藍(lán)染膠獲取圖像，PDQuest 2-DE軟件比較分析健康人和大腸癌患者組織蛋白二維電泳圖譜的差異，選取表達(dá)水平相差 2倍以上的點(diǎn)作為后續(xù)質(zhì)譜分析的候選蛋白質(zhì)點(diǎn)。

1.2.4質(zhì)譜分析。從膠中切取差異蛋白質(zhì)點(diǎn)于1.5 ml Eppendorf管中，50%乙腈和100 mmol/L碳酸氫銨脫色30 min，乙腈脫水冷凍抽干。加入10 μl TPCK處理的胰蛋白酶（0.1 mg/L）冰上吸脹60 min，37℃酶解12 h，30 μl萃取液（100%乙腈∶5%甲酸1∶1）萃取60 min，重復(fù)萃取1次。將萃取液收集于0.5 ml Eppendorf管，冷凍濃縮至總體積2-5μl。制備好的樣品在MALDI-TOF-MS質(zhì)譜儀中進(jìn)行分析儀上進(jìn)行分析。結(jié)果利用Mascot軟件檢索NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)鑒定蛋白質(zhì)。

2.結(jié)果

2.1兩組組織二維電泳圖譜的建立和圖像分析

應(yīng)用2-DE技術(shù)分別分離12例健康人直腸黏膜和10例大腸癌患者癌組織的混合蛋白?？捡R斯亮藍(lán)G-250染色后，得到了健康人和大腸癌患者組織的2-DE圖譜。為了保證結(jié)果的可靠性，在相同的條件下重復(fù)2-DE兩次，獲得兩組的2-DE圖譜各3張，采用PDquest圖像分析軟件對(duì)2-DE圖像進(jìn)行分析。結(jié)果顯示：健康人組織平均蛋白質(zhì)點(diǎn)數(shù)為1000±10，大腸癌組織平均蛋白質(zhì)點(diǎn)數(shù)為1010±5，匹配率為（93.5±5.0）%。兩種組織樣本共有26個(gè)差異點(diǎn)，其中在大腸癌組織中表達(dá)上調(diào)點(diǎn)11個(gè)，下調(diào)的點(diǎn)15個(gè)。圖1為有代表性的大腸癌組織蛋白質(zhì)的2-DE圖譜。

2.2差異蛋白質(zhì)點(diǎn)的鑒定

從膠中切取較明顯的10個(gè)差異蛋白質(zhì)點(diǎn)，進(jìn)行MALDI-TOF-MS質(zhì)譜分析。利用Mascot查詢NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)，如果Mascot分?jǐn)?shù)>56分（P<0.05）則認(rèn)為得到鑒定，否則視為未得到鑒定。在10個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)中有5個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)得到鑒定，即HSP27蛋白，S100A9蛋白，GST-π蛋白，GRP75蛋白，Aldehyde dehydrogenase X蛋白。

3.討論

不同生物學(xué)特性的腫瘤細(xì)胞具有不同的發(fā)生、發(fā)展和特殊性狀，其中蛋白表達(dá)的差異起到了重要作用。腫瘤與正常組織或細(xì)胞的蛋白質(zhì)表達(dá)譜差異分析是腫瘤蛋白質(zhì)組學(xué)研究中應(yīng)用最廣泛和最有效的手段[2，3]。本課題利用蛋白組學(xué)技術(shù)比較了大腸癌組織與正常直腸黏膜，發(fā)現(xiàn)了5種蛋白質(zhì)的表達(dá)水平均發(fā)生了明顯變化，這些差異表達(dá)的蛋白有可能成為早期診斷大腸癌的候選標(biāo)記物。本研究鑒定出的HSP27、Sl00A9和GST-π均可能與大腸癌的發(fā)生有關(guān)，可能作為大腸癌早期診斷的候選新型生物標(biāo)志物及大腸癌治療的靶標(biāo)，但這需要在以后的實(shí)驗(yàn)中進(jìn)一步證實(shí)。生物信息學(xué)分析表明，本研究篩選出的5種蛋白與細(xì)胞增殖、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、細(xì)胞周期調(diào)控等密切相關(guān)，可能在大腸癌的發(fā)生發(fā)展中起重要作用，而對(duì)這些蛋白的特性功能進(jìn)一步分析研究可為探討大腸癌的分子機(jī)制、尋找大腸癌早期診斷的分子標(biāo)記物提供實(shí)驗(yàn)和理論依據(jù)。

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