馬莉萍，左顯維，王艷鳳，李云霞，張 彪，韓根亮

(甘肅省科學(xué)院傳感技術(shù)研究所，蘭州730000)

葡萄糖生物傳感器在臨床檢驗(yàn)、發(fā)酵控制及食品分析等方面發(fā)揮著重要的作用，目前絕大多數(shù)葡萄糖生物傳感器均采用在電極表面修飾葡萄糖氧化酶(GOD)的方法來制備。但是，GOD的氧化還原活性中心位于分子中心，使酶與電極間電子傳遞很難實(shí)現(xiàn)。近年來，將納米材料引入生物傳感器以提高生物酶與基體電極之間的電子傳導(dǎo)能力成為研究熱點(diǎn)，眾多的納米材料如:Au［1－2］、Ag［3］、Pt［4］等貴重金屬以及碳納米管［5］、導(dǎo)電聚合物薄膜［6］等均已被成功地用于固定生物酶。最近又有研究發(fā)現(xiàn)新型的稀土元素納米氧化物CeO2有助于電子在電極表面的傳遞［7－8］，從而使其成為在生物傳感器領(lǐng)域極具應(yīng)用前景的一類材料。

一些研究表明，采用納米材料復(fù)合物［9－11］固定生物酶時(shí)，組成復(fù)合物的各種單元組分在納米尺度上復(fù)合，能產(chǎn)生較強(qiáng)的協(xié)同效應(yīng)，同時(shí)又具有納米粒子的特性。其中，無機(jī)納米材料與有機(jī)高分子材料形成的復(fù)合物由于集納米粒子與功能性高分子的特性于一身，在生物傳感器中極具應(yīng)用前景。在眾多有機(jī)高分子材料中，聚苯胺因合成條件簡單，具有優(yōu)良的導(dǎo)電性，已成為研究熱點(diǎn)［12－14］。將導(dǎo)電聚苯胺與無機(jī)納米材料復(fù)合，所形成的復(fù)合材料不僅具有優(yōu)良的電化學(xué)性能，而且可以使導(dǎo)電聚苯胺在中性環(huán)境下有效的進(jìn)行氧化還原反應(yīng)，拓展其在生物傳感器領(lǐng)域的應(yīng)用［15－17］。

故本文合成了基于金納米粒子、氧化鈰納米顆粒和導(dǎo)電聚苯胺的納米復(fù)合材料(Au NPs-CeO2@PANI)，以其固定GOD，實(shí)現(xiàn)對葡萄糖濃度的測定。研究表明，本文合成的Au NPs-CeO2@PANI納米復(fù)合材料同時(shí)兼具了三種單一材料各自的優(yōu)點(diǎn)，該納米材料實(shí)現(xiàn)了酶與電極間的直接電子轉(zhuǎn)移，有效地提高了傳感器的電流響應(yīng)、靈敏度和使用壽命，在葡萄糖電化學(xué)生物傳感器中具有較好的應(yīng)用前景。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑

苯胺(An):分析純(使用前減壓蒸餾);硝酸鈰(Ce(NO3)3·6H2O)，氯金酸(HAuC14)，檸檬酸三鈉(C6H5O7Na3·2H2O)，過硫酸銨 ((NH4)2S2O8，APS)，鹽酸(HCl)，硝酸(HNO3)，乙醇(C2H6O)均為化學(xué)純;以上試劑均購于上?；瘜W(xué)試劑廠。葡萄糖氧化酶(GOD)，殼聚糖(Chit，脫乙酰度85%)，均購于美國Sigma公司。

1.2 儀器

復(fù)合材料表征:JEM－100SX型電子透射顯微鏡(日本電子公司);D/MAX－3C型X射線衍射儀(日本Rigaku公司);FTS3000FX型的傅立葉變換紅外光譜儀(美國DIGILAB公司)，KBr壓片;PE-PYRIS Diamond TG/DTA熱重分析儀。

電化學(xué)實(shí)驗(yàn):AUTOLAB PGSTAT 128N模塊式電化學(xué)綜合測試系統(tǒng)(瑞士萬通公司)，電化學(xué)測量采用三電極體系:酶電極為工作電極，鉑片電極作輔助電極，飽和甘汞(SCE)電極為參比電極。所有電化學(xué)實(shí)驗(yàn)均在室溫下進(jìn)行。

1.3 Au NPs-CeO2@PANI納米復(fù)合材料的合成

參照已報(bào)道的文獻(xiàn)［18－19］，首先制備出氧化鈰納米顆粒和金溶膠。然后，按以下步驟合成Au NPs-CeO2@PANI納米復(fù)合材料:①將一定量的CeO2納米顆粒超聲分散在20 mL 1 mol/L HCl溶液中，再加入1 mL苯胺單體，超聲分散30 min，形成懸浮液 A;②將2.49 g(NH4)2S2O8溶解在 5 mL 1 mol/L鹽酸溶液中，形成溶液B。③用滴液漏斗將B緩慢滴加到A中，在磁力攪拌下反應(yīng)12 h。反應(yīng)結(jié)束后離心分離，分別用0.1 mol/L鹽酸溶液、乙醇和二次水洗滌產(chǎn)物至離心液為無色，60℃真空干燥24 h，得到CeO2@PANI納米復(fù)合材料。④將經(jīng)①②③步所得的具有核－殼結(jié)構(gòu)的CeO2@PANI納米復(fù)合材料在濃度為1.0 mg/mL金溶膠中攪拌12 h后，離心分離，并將產(chǎn)物真空干燥，既得Au NPs-CeO2@PANI納米復(fù)合材料。

采用上述類似方法制備了摻雜態(tài)PANI、CeO2@PANI納米復(fù)合材料及Au NPs-PANI納米復(fù)合材料。

1.4 Chit/Au NPs-CeO2@PANI/GOD 修飾電極的制備

直徑為2 mm的鉑盤電極用0.3及0.5 μm的Al2O3拋光粉打磨，依次用去離子水、無水乙醇及丙酮超聲清洗3 min。然后在0.5%H2SO4中進(jìn)行電化學(xué)預(yù)處理，以增加電極表面電活性點(diǎn)的濃度，將電極在－0.4 V～+1.0 V下以50 mV/s掃速循環(huán)伏安掃描30圈至穩(wěn)定。

將制備好的Au NPs-CeO2@PANI納米復(fù)合材料在去離子水中超聲分散2 h，使溶液濃度為1.0 mg/mL;取 Au NPs-CeO2@PANI納米復(fù)合材料、1 mg/μL葡萄糖氧化酶及質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.0%殼聚糖，按體積比為3∶3∶1充分混勻后滴于電極表面，4℃放置晾干，作為工作電極。對照組各修飾電極的制備同上。

1.5 測量方法

電化學(xué)測量采用三電極系統(tǒng):鉑盤電極(直徑3 mm)為工作電極，飽和甘汞(SEC)電極為參比電極，鉑片為對電極;以0.2 mol/L磷酸鹽緩沖溶液(pH 7.0)為支持電解質(zhì)，室溫條件下，加入不同濃度葡萄糖，在0.8 V～0.2 V范圍內(nèi)進(jìn)行循環(huán)伏安掃描，記錄循環(huán)伏安掃描曲線。電流時(shí)間曲線測定時(shí)，工作電位為－0.55 V(vs.SCE)，攪拌時(shí)測定。測試時(shí)體系通N2除O2。

2 結(jié)果與討論

2.1Au NPs-CeO2@PANI納米復(fù)合材料的結(jié)構(gòu)表征

圖1(a)為Au NPs-CeO2@PANI納米復(fù)合材料的透射電鏡(TEM)圖，從圖中可看出顏色較深的無機(jī)物CeO2納米顆粒被完全包埋在顏色較淺的無定形的有機(jī)物聚苯胺中，形成了核－殼結(jié)構(gòu);殼層聚苯胺的厚度大約有25 nm，而被包埋的CeO2核平均粒徑在10 nm左右。TEM圖中像蓖麻一樣的小黑點(diǎn)為金納米顆粒，這些金納米顆粒均被牢牢地吸附在聚苯胺的表面。在圖中沒有觀察到有機(jī)相與無機(jī)相兩相的分離現(xiàn)象，這說明無機(jī)物CeO2、Au與有機(jī)物 PANI之間很好的復(fù)合在了一起。

圖1 Au NPs-CeO2@PANI納米復(fù)合材料的TEM圖(a)和XRD譜圖(b)

圖1(b)為Au NPs-CeO2@PANI納米復(fù)合材料X射線衍射譜(XRD)，在 2θ=15.48°、20.30°和 25.10°處出現(xiàn)了寬的衍射峰為結(jié)晶態(tài)聚苯胺的特征衍射峰［14］;在 2θ=28.4°，32.3°，46.7°，55.9°，58.1°和67.5°處出現(xiàn)的衍射峰與立方晶系CeO2的標(biāo)準(zhǔn)譜圖(JCPDS卡號 No.34－0394)一致;而另外在 2θ=37.1°，44.2°，63.4°，和 77.8°的四處衍射峰與立方晶系A(chǔ)u的標(biāo)準(zhǔn)譜圖(JCPDS卡號No.01－1172)一致，這表明該樣品是由聚苯胺、CeO2和組成Au的。根據(jù)Scherrer公式 D=k(/βcosθ(k 取 0.89，(為 0.154 nm)，由2θ=28.4°處半峰寬計(jì)算出樣品中 CeO2粒子的粒徑為10.5 nm，這與TEM結(jié)果基本一致。

2.2 修飾電極的電化學(xué)特性

圖2為不同修飾電極在0.2 mol/L PBS(pH=7.0)中的循環(huán)伏安掃描圖掃速為50 mV/s。由圖中可看出，GOD修飾的電極沒有氧化還原峰(圖2(a))，表明酶與電極間的電子轉(zhuǎn)移無法實(shí)現(xiàn);Chit/CeO2-PANI/GOD及Chit/Au-PANI/GOD修飾的電極氧化還原峰不明顯(圖2(b)、(c))，表明這些材料修飾的電極表面酶與電極間的電子轉(zhuǎn)移較難實(shí)現(xiàn);而Chit/Au-CeO2-PANI/GOD修飾電極出現(xiàn)了較為對稱的氧化還原峰(圖2(d))，峰電勢分別為在0.55和0.03，說明該修飾電極使酶與電極間的電子轉(zhuǎn)移容易實(shí)現(xiàn)，并且葡萄糖氧化酶在電極上保持了良好的生物活性。

Au NPs-CeO2@PANI納米復(fù)合材料在中性條件下有良好的氧化還原活性，且有效的實(shí)現(xiàn)了酶與電極之間的直接電子轉(zhuǎn)移，主要是因?yàn)?①CeO2具有較高的等電點(diǎn)(IEP)(9.0)，它適合吸附具有低IEP(4.2)的GOD，對帶負(fù)電性的GOD提供友好的微環(huán)境，能在很大程度上促進(jìn)GOD和電極之間的電子傳遞;②PANI能很好的催化GOD，同時(shí)，納米結(jié)構(gòu)的PANI負(fù)載酶時(shí)，其巨大的比表面積增加了載酶量;③納米Au的優(yōu)良導(dǎo)電性能。本文合成的Au NPs-CeO2@PANI納米復(fù)合材料同時(shí)兼具了三種單一材料各自的優(yōu)點(diǎn)，而且復(fù)合材料比單一納米顆粒更易于形成連續(xù)勢場，可降低電子在電極和固定化酶間的遷移阻力，能有效加速GOD的再生過程，顯著增強(qiáng)了傳感器的電流響應(yīng)。

圖2 不同修飾電極在0.2 mol/L PBS(pH 7.0)中的循環(huán)伏安掃描圖，掃速為50 mV/s

圖3為Chit/Au-CeO2-PANI/GOD修飾電極在10 mmol/L葡萄糖溶液中不同掃速下的循環(huán)伏安圖，從圖中可看到，隨著掃速從10 mV/s增加到100 mV/s，GOD氧化還原峰電流隨掃描速率的增加而增大，這是因?yàn)殡S著掃描速度加快，單位時(shí)間通過電極表面的電子增多使電流變大;而圖3中峰電勢差為0.52 V，峰電勢差不隨掃速的變化而變化，表明電極反應(yīng)是準(zhǔn)可逆過程。插圖為峰電流與掃速的平方根的關(guān)系圖，經(jīng)計(jì)算陽極和陰極的峰電流Ip與掃描速率的平方根成線性關(guān)系(見圖3插圖)，表明修飾電極上的電化學(xué)反應(yīng)主要是受擴(kuò)散控制。此外，在連續(xù)的掃描過程中C－V圖基本保持不變，說明GOD的活性在Chit/Au-CeO2-PANI復(fù)合膜中是穩(wěn)定的。

圖3 Chit/Au-CeO2-PANI/GOD修飾電極在不同掃速下的循環(huán)伏安圖(插圖：峰電流與掃速的平方根的關(guān)系圖)

2.3 Chit/Au-CeO2-PANI/GOD修飾電極對葡萄糖催化的電化學(xué)行為

圖4是Chit/Au-CeO2-PANI/GOD修飾電極在PBS(pH=7.0)溶液中及1 mmol/L葡萄糖溶液中的循環(huán)伏安曲線比較圖。由圖可知，當(dāng)加入葡萄糖之后(圖4b)，氧化峰電流明顯增大，顯示了明顯的GOD對葡萄糖的催化氧化能力。

圖4 修飾電極的CV圖

2.4 電流時(shí)間曲線及線性檢測

圖5為在0.55 V電位下 Chit/Au-CeO2-PANI/GOD修飾電極對葡萄糖的電流響應(yīng)隨葡萄糖濃度變化的計(jì)時(shí)安培動(dòng)力學(xué)曲線。由圖可見，氧化峰電流隨著葡萄糖濃度的增加呈臺階式上升，電極電流響應(yīng)時(shí)間為5 s，表明Chit/Au-CeO2-PANI復(fù)合膜吸附固定的GOD對葡萄糖具有優(yōu)良的催化氧化能力，可在電極表面迅速建立氧化還原平衡反應(yīng)。在6.2×10－6mol/L ～2.8×10－3mol/L 范圍內(nèi)，電極電流響應(yīng)與葡萄糖濃度呈線性關(guān)系(圖5插圖)，檢測下限為1.0×10－6mol/L，線性方程:I(μA)=0.118+5.065 C(mmol/L)，相關(guān)系數(shù)為0.996 8。隨著葡萄糖濃度的進(jìn)一步增加，電流到達(dá)平臺期，遵從Michaelis-Menten kinetics動(dòng)力學(xué)方程的特性。

圖5 傳感器對葡萄糖響應(yīng)的電流－時(shí)間曲線(插圖：電極電流響應(yīng)與葡萄糖濃度的線性關(guān)系圖)

相同條件下，Au修飾電極檢測葡萄糖線性線性范圍為 4.0×10－5mol/L ～1.0×10－3mol/L，響應(yīng)時(shí)間10 s;CeO2-PANI修飾電極檢測葡萄糖線性線性范圍為 9.0×10－4mol/L ～ 1.0×10－2mol/L，響應(yīng)時(shí)間15 s，Au-PANI檢測葡萄糖線性線性范圍為1.0×10－5mol/L ～ 1.0×10－3mol/L，響應(yīng)時(shí)間 8 s。說明Au NPs-CeO2@PANI納米復(fù)合材料修飾的電極顯示出了比單一或二者復(fù)合的納米材料修飾電極更優(yōu)越的性能。

2.5 傳感器的穩(wěn)定性檢測

圖6為Chit/Au-CeO2-PANI/GOD修飾電極的穩(wěn)定性檢測。電極不用時(shí)保存于4℃。該電極在保存5天后，酶活下降約4%，三周后，電極對葡萄糖的響應(yīng)仍能保持原來的80%(如圖6所示)，可見該傳感器有較好的穩(wěn)定性。表明Chit/Au-CeO2-PANI復(fù)合膜能很好地固定GOD，使用納米材料能最大限度的保持酶的活力。

圖6 傳感器的穩(wěn)定性檢測

3 結(jié)論

本文首先成功合成了Au NPs-CeO2@PANI納米復(fù)合材料，對其進(jìn)行了表征。然后，將該納米復(fù)合材料應(yīng)用于葡萄糖生物傳感器中，并對傳感器進(jìn)行了電化學(xué)性能測試。研究結(jié)果表明，該Au NPs-CeO2@PANI納米復(fù)合材料修飾的電極比單一或任意二者復(fù)合材料修飾電極具有更好的電催化活性，顯示了優(yōu)越的性能，如:高靈敏度、低檢測限、高穩(wěn)定性等，提高了電極與生物酶之間的電子轉(zhuǎn)移。該生物傳感器檢測葡萄糖的線性范圍為 6.2×10－6mol/L ～ 2.8×10－3mol/L，響應(yīng)時(shí)間為5 s，檢測下限為1.0×10－6mol/L。

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