庹清章，董江濤，田璽擇，劉云霞，董偉杰，劉丹霞，李微，吳芳，章樂，張萬江

（石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)教研室／新疆地方與民族高發(fā)病教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，石河子 832002）

結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌（Mycobacterium Tuberculosis）引起的一種世界性傳染病，也是單一致病菌感染導(dǎo)致死亡率最高的感染性疾病。結(jié)核分枝桿菌感染人體后，主要被宿主巨噬細(xì)胞吞噬，未被機(jī)體免疫系統(tǒng)清除而潛伏下來的結(jié)核分枝桿菌，也主要寄生于宿主巨噬細(xì)胞內(nèi)。近期研究發(fā)現(xiàn)，結(jié)核分枝桿菌小分子熱休克蛋白Hsp16.3對結(jié)核分枝桿菌在宿主巨噬細(xì)胞中的潛伏扮演著重要作用，因此對敲除Hsp16.3基因而得到的結(jié)核分枝桿菌突變菌株在感染的不同時(shí)期宿主巨噬細(xì)胞凋亡率的研究，可為深入探討結(jié)核分枝桿菌小分子熱休克蛋白Hsp16.3在感染宿主巨噬細(xì)胞中的作用奠定基礎(chǔ)，從而為結(jié)核病的發(fā)病機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

8周齡SPF級（無特定病原體動(dòng)物）昆明小鼠，雌雄各半，共160只，體重（18～20）g，購于石河子大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.1.2 菌種

結(jié)核分枝桿菌H37Rv和卡介苗（BCG）菌株購于中國藥品生物制品檢定所，結(jié)核分枝桿菌H37Rv株Hsp16.3基因缺失突變株（△H37Rv）和卡介苗菌株Hsp16.3基因缺失突變株（△BCG）由本課題組提供。

1.1.3 主要試劑

Mycobacterium Tuberculosis 65kD antibody（只針對結(jié)核分枝桿菌的65kD的小鼠單克隆抗體）、FITC熒光標(biāo)記的二抗（山羊抗小鼠）、Annexin V－FITC／PI調(diào)亡檢測試劑盒（美國Biovision公司）。

1.1.4 主要儀器

激光共聚焦顯微鏡、流式細(xì)胞儀（德國Partec－PAS）、生物安全柜等。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分為H37Rv菌株組、△H37Rv菌株組、BCG組和△BCG組。每組40只，不同時(shí)間段各設(shè)5只。

1.2.2 結(jié)核病小鼠模型的建立

方法參見文獻(xiàn)［1］：在生物安全柜內(nèi)，取在改良羅氏培養(yǎng)基上生長2～3周狀態(tài)良好的結(jié)核分枝桿菌菌落，置滅菌研菌器中，加少量含0.05%Tween－20的生理鹽水溶液充分研磨，使其成均勻渾濁的菌懸液。麥?zhǔn)媳葷岱ㄕ{(diào)細(xì)菌濃度約1.0×107CFU／mL。將各組不同菌懸液經(jīng)小鼠尾靜脈分別注射到對應(yīng)分組的每只小鼠體內(nèi)，注射量為0.3mL（約含活菌量3×106CFU／mL）。感染小鼠置生物安全三級實(shí)驗(yàn)室內(nèi)，IVC籠具中飼養(yǎng)。

1.2.3 小鼠肺泡巨噬細(xì)胞的分離

小鼠于感染后第1、3、5、7、9、11、13、15d經(jīng)眼球放血，脫頸處死，暴露氣管，用消毒好的組織剪在氣管上做一切口（切勿剪斷），用連有注射器的無菌軟皮管從切口處插入氣管，絲線固定，用預(yù)熱至37℃的PBS液行支氣管肺泡灌洗，1.0mL×10次，收集支氣管肺泡灌洗液，4℃1500r／min離心10 min，PBS液洗滌細(xì)胞1次。棄上清，加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，轉(zhuǎn)入細(xì)胞培養(yǎng)瓶中。置37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)4h，棄上清液和非貼壁的細(xì)胞，貼壁的即為小鼠肺泡巨噬細(xì)胞。

1.2.4 激光共聚焦顯微鏡觀察各組感染小鼠肺泡巨噬細(xì)胞

收集感染小鼠肺泡巨噬細(xì)胞，經(jīng)爬片、固定、封閉后，滴加稀釋后的一抗（稀釋度1∶1500），均勻鋪于玻片上，濕盒內(nèi)放置，4℃過夜。PBS沖洗3min×3次，滴加熒光二抗（稀釋度1∶500），室溫2h，PBS沖洗干凈，硝酸甘油封片，于激光共聚焦顯微鏡下觀察熒光強(qiáng)度及著色部位。

1.2.5 小鼠肺泡巨噬細(xì)胞凋亡檢測

收集各組、各時(shí)間點(diǎn)小鼠肺泡巨噬細(xì)胞，Annexin V－FITC／PI染色，1h內(nèi)流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡，Cellquest軟件獲取數(shù)據(jù)。

1.2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 應(yīng)用激光共聚焦顯微鏡觀察各組感染小鼠肺泡巨噬細(xì)胞

感染小鼠肺泡巨噬細(xì)胞內(nèi)結(jié)核分枝桿菌膜上的熱休克蛋白Hsp65與一抗（只針對結(jié)核分枝桿菌的65kD的小鼠單克隆抗體）結(jié)合，再與FITC（綠色熒光）標(biāo)記的二抗結(jié)合。在激光共聚焦顯微鏡下，結(jié)核分枝桿菌四種類型菌株感染的小鼠肺泡巨噬細(xì)胞內(nèi)均可見大量綠色熒光（圖1），表明結(jié)核分枝桿菌4種類型菌株均被小鼠肺泡巨噬細(xì)胞大量吞噬。

圖1 激光共聚焦顯微鏡檢測感染小鼠肺泡巨噬細(xì)胞Fig.1 Detection of the infected mice alveolar macrophages by CLSM

2.2 結(jié)核分枝桿菌4種類型菌株分別感染小鼠后誘導(dǎo)小鼠肺泡巨噬細(xì)胞凋亡的流式細(xì)胞技術(shù)分析

經(jīng)流式細(xì)胞技術(shù)檢測，Cellquest軟件分析得出細(xì)胞凋亡率（圖2）和各時(shí)間點(diǎn)各感染組凋亡情況（表1）。根據(jù)檢測結(jié)果，我們建立了結(jié)核桿菌感染小鼠肺泡巨噬細(xì)胞的凋亡率——時(shí)間曲線（圖3）。

圖2 巨噬細(xì)胞凋亡的流式圖Fig.2 Time－dependent effect of the infected mice alveolar macrophage apoptosis

表1 各組不同時(shí)間點(diǎn)巨噬細(xì)胞凋亡情況 %，ˉTab.1 The apoptosis rate of macrophages at different time points in each group

表1 各組不同時(shí)間點(diǎn)巨噬細(xì)胞凋亡情況 %，ˉTab.1 The apoptosis rate of macrophages at different time points in each group

時(shí)間／d 數(shù)量 H37Rv △H37Rv BCG △BCG 1 5 1.68±0.28 8.64±0.38 0.60±0.09 9.46±0.43 3 5 6.46±0.39 10.79±0.43 0.84±0.22 6.75±0.63 5 5 7.19±0.34 14.39±1.15 1.63±0.97 2.40±0.36 7 5 12.80±0.56 17.77±0.44 1.49±0.77 0.44±0.11 9 5 17.41±0.68 9.25±0.35 2.49±0.72 0.89±0.11 11 5 12.61±1.53 8.22±0.35 1.13±0.99 0.55±0.06 13 5 3.38±1.28 7.00±0.19 1.16±0.28 0.52±0.04 15 5 2.23±0.18 6.06±0.16 0.57±0.12 0.41±0.05

圖3 各組巨噬細(xì)胞凋亡率－時(shí)間曲線Fig.3 The relationship between apoptosis rate and infection time

從圖3可以看出：

1）小鼠感染結(jié)核分枝桿菌H37Rv株Hsp16.3基因缺失突變株（△H37Rv）后，巨噬細(xì)胞的凋亡率逐漸上升，至感染7d時(shí)達(dá)到高峰，隨后逐漸降低。

2）與H37Rv株感染組相比，1～7d內(nèi)，各時(shí)間段△H37Rv菌株組巨噬細(xì)胞凋亡率均顯著高于H37Rv菌株組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），隨時(shí)間延長，巨噬細(xì)胞凋亡程度發(fā)生了逆轉(zhuǎn)，9～11d內(nèi)，△H37Rv菌株組巨噬細(xì)胞凋亡率低于H37Rv菌株組，而13～15d內(nèi)，△H37Rv菌株組巨噬細(xì)胞凋亡率高于H37Rv菌株組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

3）△BCG組凋亡率1～7d內(nèi)呈現(xiàn)明顯下降趨勢，7d后巨噬細(xì)胞凋亡率變化趨于平穩(wěn)，與BCG組相比，1～5d內(nèi)，△BCG組凋亡率顯著高于BCG組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），7～15d內(nèi)，△BCG組與BCG組巨噬細(xì)胞凋亡率無明顯差異。

3 討論

結(jié)核分枝桿菌是典型的胞內(nèi)致病菌，主要在巨噬細(xì)胞等宿主免疫系統(tǒng)的細(xì)胞內(nèi)存活和繁殖。結(jié)核分枝桿菌感染人體后，主要被宿主巨噬細(xì)胞吞噬，未被機(jī)體免疫系統(tǒng)清除而潛伏下來的結(jié)核分枝桿菌，也主要寄生于宿主巨噬細(xì)胞內(nèi)。宿主巨噬細(xì)胞在結(jié)核分枝桿菌與宿主相互作用的過程中具有重要作用，結(jié)核分枝桿菌感染的后果以及結(jié)核病的發(fā)生與否與宿主巨噬細(xì)胞密切相關(guān)［2］。宿主巨噬細(xì)胞發(fā)生凋亡后，可殺死寄生于其內(nèi)的結(jié)核分枝桿菌，阻止結(jié)核分枝桿菌在體內(nèi)的播散，并能激活鄰近未感染的巨噬細(xì)胞，增強(qiáng)機(jī)體對結(jié)核分枝桿菌的殺傷能力［3］。因此，巨噬細(xì)胞的凋亡情況對于寄生于其中的結(jié)核分枝桿菌的命運(yùn)至關(guān)重要。也正因如此，結(jié)核分枝桿菌要想成功地在宿主巨噬細(xì)胞中存活，就必須通過某些機(jī)制對宿主巨噬細(xì)胞的凋亡進(jìn)程進(jìn)行干預(yù)和調(diào)控［4］。

在結(jié)核分枝桿菌感染的過程中，結(jié)核分枝桿菌與宿主巨噬細(xì)胞相互作用及相互適應(yīng)，可調(diào)控宿主巨噬細(xì)胞的調(diào)亡。一方面，結(jié)核分枝桿菌可誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞凋亡；另一方面，結(jié)核分枝桿菌亦具有抑制巨噬細(xì)胞凋亡的作用，當(dāng)這兩種作用達(dá)到平衡時(shí)，結(jié)核分枝桿菌則以休眠狀態(tài)存在于巨噬細(xì)胞中，形成所謂的“逃避”，使自身的存活、繁殖與宿主的一系列免疫反應(yīng)達(dá)到一種動(dòng)態(tài)平衡［5］。

結(jié)核分枝桿菌小分子熱休克蛋白（sHSPs，small heat shock proteins）Hsp16.3是近年研究發(fā)現(xiàn)的結(jié)核分枝桿菌中一個(gè)存在于膜上的主要抗原蛋白，由144個(gè)氨基酸組成，相對分子質(zhì)量為16277u，等電點(diǎn)為4.85，序列分析表明它屬于sHsps家族。結(jié)核分枝桿菌小分子熱休克蛋白Hsp16.3是一個(gè)組成性表達(dá)蛋白，正常條件下有少量表達(dá)［6］，在結(jié)核分枝桿菌進(jìn)入靜止生長期時(shí)結(jié)核分枝桿菌小分子熱休克蛋白 Hsp16.3顯著表達(dá)［7－8］。

結(jié)核分枝桿菌小分子熱休克蛋白Hsp16.3對結(jié)核分枝桿菌在宿主巨噬細(xì)胞中的潛伏扮演著重要作用，結(jié)核分枝桿菌進(jìn)入巨噬細(xì)胞后大量表達(dá)合成結(jié)核分枝桿菌小分子熱休克蛋白Hsp16.3；敲除Hsp16.3基因而得到的突變菌株在體外的生長情況與正常菌株相同，但突變菌株不能在鼠骨髓衍生的巨噬細(xì)胞以及 THP－1細(xì)胞株中生長［9－10］，說明結(jié)核分枝桿菌小分子熱休克蛋白Hsp16.3可能對結(jié)核分枝桿菌在巨噬細(xì)胞中的潛伏起著保護(hù)作用，同時(shí)有研究進(jìn)一步證明，結(jié)核分枝桿菌進(jìn)入宿主巨噬細(xì)胞時(shí)誘導(dǎo)大量表達(dá)的Hsp16.3對結(jié)核分枝桿菌能夠在宿主巨噬細(xì)胞內(nèi)長期生長、繁殖和致病扮演著重要作用，一方面有助于結(jié)核分枝桿菌細(xì)胞膜增厚，以及增強(qiáng)結(jié)核分枝桿菌抵抗脅迫環(huán)境，如NO、氧自由基、缺氧等因素的抗氧化能力等，同時(shí)使結(jié)核分枝桿菌在宿主巨噬細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)變成靜止期，有助于結(jié)核分枝桿菌在宿主巨噬細(xì)胞內(nèi)成為滯留菌，長期在宿主巨噬細(xì)胞內(nèi)生長繁殖［11－12］。盡管發(fā)現(xiàn)結(jié)核分枝桿菌小分子熱休克蛋白Hsp16.3對于結(jié)核分枝桿菌在宿主巨噬細(xì)胞內(nèi)的生存是必需的，但是其在體內(nèi)的生理功能以及相關(guān)的保護(hù)機(jī)制卻并不知道［13－14］。

本次實(shí)驗(yàn)中，我們通過流式細(xì)胞技術(shù)動(dòng)態(tài)檢測結(jié)核分枝桿菌小分子熱休克蛋白Hsp16.3基因缺失突變菌株感染小鼠肺泡巨噬細(xì)胞的凋亡率在不同時(shí)間的變化情況，同時(shí)與結(jié)核分枝桿菌正常菌株對比，結(jié)果顯示：小鼠感染結(jié)核分枝桿菌H37Rv株Hsp16.3基因缺失突變株（△H37Rv）后，巨噬細(xì)胞的凋亡率逐漸上升，至感染7d時(shí)達(dá)到高峰，隨后逐漸降低，1～7d內(nèi)，各時(shí)間段△H37Rv感染組巨噬細(xì)胞凋亡率均顯著高于H37Rv菌株組（P＜0.05），9～11d內(nèi)，△H37Rv感染組巨噬細(xì)胞凋亡率反而低于H37Rv菌株組，而13～15d內(nèi)，△H37Rv菌株組巨噬細(xì)胞凋亡率又高于H37Rv菌株組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）?！鰾CG感染組凋亡率1～7d內(nèi)呈現(xiàn)明顯下降趨勢，7d后巨噬細(xì)胞凋亡率變化趨于平穩(wěn)，且1～5d內(nèi)，△BCG組凋亡率顯著高于BCG組（P＜0.05），7～15d內(nèi)，△BCG組與BCG組巨噬細(xì)胞凋亡率無明顯差異。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：結(jié)核分枝桿菌H37Rv株小分子熱休克蛋白Hsp16.3基因缺失突變株在感染的早期和晚期誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞凋亡的能力強(qiáng)于正常菌株（H37Rv株），而卡介苗菌株小分子熱休克蛋白Hsp16.3基因缺失突變株只在早期階段（1～5d內(nèi)）誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞凋亡的能力強(qiáng)于正常菌株（BCG），7d后與正常菌株（BCG）無明顯差異。這一結(jié)果表明，結(jié)核分枝桿菌小分子熱休克蛋白Hsp16.3在MTB感染的早期和晚期能夠抑制小鼠肺泡巨噬細(xì)胞的凋亡，至于如何發(fā)揮這種抑制作用，有待進(jìn)一步研究。

結(jié)核桿菌感染過程中，免疫細(xì)胞如巨噬細(xì)胞凋亡發(fā)生的時(shí)機(jī)及機(jī)制在抗結(jié)核中發(fā)揮的作用目前尚無定論。就誘導(dǎo)細(xì)胞免疫而言，在結(jié)核桿菌感染的初期，巨噬細(xì)胞大量凋亡將不利用巨噬細(xì)胞提呈抗原，機(jī)體難以建立有效的抗結(jié)核細(xì)胞免疫效應(yīng)，而感染晚期發(fā)生的凋亡使結(jié)核桿菌失去了巨噬細(xì)胞提供的保護(hù)環(huán)境，機(jī)體易于將其殺傷。

結(jié)核病的發(fā)生與發(fā)展過程中伴隨機(jī)體免疫細(xì)胞的凋亡是機(jī)體與結(jié)核分枝桿菌之間相互斗爭的結(jié)果。對其機(jī)制的深入研究將有助于我們對結(jié)核病本身的認(rèn)識(shí)，同時(shí)也為結(jié)核病的控制和根除提供新的思路。

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