趙伊英，武萬峰，汪小東，張建華

（石河子大學(xué)農(nóng)學(xué)院，石河子 832003）

精氨酸激酶（Arginine Kinase，AK）（ATP：Argine L－phosphotransferase EC 2.7.3.3）屬于磷酸原激酶家族中的重要一員，廣泛的存在于無脊椎動物如昆蟲、蝦、蟹及軟體動物中［1－4］，起著類似于脊椎動物中肌酸激酶（Creatine Kinase，CK）（ATP：Creatine L－phosphotransferase EC 2.7.3.2）的作用，是一個與細(xì)胞內(nèi)能量運轉(zhuǎn)、肌肉收縮、ATP再生有直接關(guān)系的重要激酶［5－8］。

在昆蟲體內(nèi)，AK是唯一的磷酸原激酶，屬于單亞基蛋白。在昆蟲運動過程中，磷酸精氨酸是唯一有效形成ATP的磷?；w，能在一定時間內(nèi)為劇烈運動提供能量，同時又維持 ATP的恒定［3］。AK是昆蟲生命活動過程中參與能量代謝的關(guān)鍵酶，而且僅存在于無脊椎動物中，與脊椎動物中參與能量代謝的CK不同。因此，AK可以作為控制昆蟲能量代謝的一個很好的靶標(biāo)蛋白，可以減少農(nóng)藥的使用，減少環(huán)境壓力，而且對高等動物的安全性良好［9］。

本實驗在我們前期克隆獲得石河子棉區(qū)棉鈴蟲AK基因的基礎(chǔ)上，構(gòu)建了原核生物表達(dá)載體pET28－AK，成功表達(dá)出了AK蛋白，為以后進(jìn)行AK分子結(jié)構(gòu)研究，深入理解AK基因的表達(dá)調(diào)控及功能提供了分子生物學(xué)基礎(chǔ)。同時，還以棉鈴蟲16SrRNA作為內(nèi)標(biāo)基因，運用實時熒光定量PCR技術(shù)研究石河子田間品系棉鈴蟲與敏感品系棉鈴蟲體內(nèi)AK基因的表達(dá)量，確定兩品系棉鈴蟲生命代謝活動的能力，旨在推測其對外界環(huán)境適應(yīng)能力強弱，為石河子地區(qū)棉鈴蟲的防治和施藥提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試蟲源、菌株

棉鈴蟲［Helicoverpa armigera （Hübner）］：石河子抗性品系（采集于石河子泉水地鎮(zhèn)、桃花鎮(zhèn)和農(nóng)試場3個棉花種植區(qū)）、敏感品系（敏感品系由河南濟(jì)源白云實業(yè)有限公司提供）。實驗用棉鈴蟲的蟲齡是六齡。

含AK基因的載體pMD18－AK，大腸桿菌菌株E.coli TOP10，BL21，原核表達(dá)載體pET－28a均為新疆兵團(tuán)綠洲生態(tài)農(nóng)業(yè)重點實驗室保存。

1.1.2 質(zhì)粒及主要試劑

Taq DNA聚合酶、限制性內(nèi)切酶、T4－DNA連接酶、DNA Marker等均購自大連寶生物公司。

熒光定量PCR試劑盒購自北京博奧生物技術(shù)有限公司。DNA凝膠回收試劑盒、高純總RNA快速提取試劑盒（離心柱型）等購自北京百泰克生物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 AK基因在原核細(xì)胞中的蛋白表達(dá)

提取并純化質(zhì)粒pET－28a和pMD18－AK，分別用Bam HI和Hind III分別進(jìn)行雙酶切，回收目標(biāo)片段，連接產(chǎn)物pET28a－AK轉(zhuǎn)化E.coli TOP10感受態(tài)，PCR鑒定正確的陽性克隆后，提取重組質(zhì)粒pET28a－AK，轉(zhuǎn)化宿主菌BL21感受態(tài)細(xì)胞。

挑取含重組質(zhì)粒pET28a－AK的菌落于LB液體培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)。取過夜培養(yǎng)物1mL接種于100mL新鮮的含Kan抗生素的LB液體培養(yǎng)基中，在37℃培養(yǎng)至菌液OD600約0.4～0.6時，加入IPTG至終濃度0.5mmol／L，37℃誘導(dǎo)5h后收獲菌體，在冰水浴上進(jìn)行超聲波破碎細(xì)胞（4次，共15 s）；然后離心（4℃，12000r／min，5min），收集上清液，SDS－PAGE電泳鑒定蛋白質(zhì)的誘導(dǎo)表達(dá)情況。

對照為含非重組質(zhì)粒pET－28a的BL21，處理的方式相同。

1.2.2 AK基因的實時定量PCR分析

采用Bio－Rad微量紫外分光光度計測定目標(biāo)基因重組質(zhì)粒的濃度和A260／280值，然后計算其拷貝數(shù)。

將重組質(zhì)粒按10倍濃度進(jìn)行稀釋，從10－1～10－7拷貝數(shù)進(jìn)行定量PCR擴(kuò)增，通過PCR的擴(kuò)增效率和標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性關(guān)系確定其準(zhǔn)確性。

標(biāo)準(zhǔn)曲線由SmartCycler II熒光定量PCR儀分析軟件自動生成，相關(guān)系數(shù)用R2表示。

選取了16SrRNA作為內(nèi)標(biāo)基因，分別對16S RNA、石河子田間品系棉鈴蟲AK、敏感品系A(chǔ)K基因的質(zhì)粒從10－1～10－7按10倍梯度稀釋后進(jìn)行定量PCR反應(yīng)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

實時定量PCR反應(yīng)按三步法在SmartCycler II實時熒光定量PCR儀進(jìn)行，模板cDNA為前期試驗提取棉鈴蟲RNA后的反轉(zhuǎn)錄cDNA。

PCR 反應(yīng)體系為：EvaGreen（20×）0.6μL，PCR buffer for EvaGreen（2）12.5μL，上下游引物各0.2μL，cDNA 模板2μL，hot start Taq（5U／μL）0.3μL，DEPC無菌水補齊到25μL。

反應(yīng)條件為：95℃120s；95℃15s，54℃20 s，72℃20s，共45個循環(huán)。

所有數(shù)據(jù)被收集后，目標(biāo)基因表達(dá)用內(nèi)標(biāo)基因進(jìn)行校正，基因表達(dá)量以16SrRNA表達(dá)量的校正值作為參比值，用于比較不同時間點的相對表達(dá)差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 重組質(zhì)粒載體pET28－AK的構(gòu)建

將原核表達(dá)載體pET－28a分別用BamH I和HindⅢ酶切回收（圖1），再與前期我們已從含目標(biāo)基因的克隆載體pMD18－AK（BamH I和HindⅢ酶切）回收的目標(biāo)片段（圖1）進(jìn)行連接得到重組表達(dá)載體pET28a－AK。將其轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21中，PCR鑒定篩選陽性克隆菌株，獲得重組表達(dá)載體pET28a－AK（圖3）。

圖1 pET－28a雙酶切片段回收Fig.1 pET28－a digested by BamH I and HindⅢ

圖2 BamH I和HindⅢ酶切pMD18－AK片段的電泳Fig.2 Electrophoresis fragment of pMD18－AK digested by BamH I and HindⅢ

2.2 精氨酸激酶蛋白的表達(dá)

原核表達(dá)結(jié)果表明，含非重組載體pET－28a的E.coli BL21，經(jīng)誘導(dǎo)后未檢測到目標(biāo)條帶，而含目標(biāo)基因的重組載體的BL21，經(jīng)過IPTG的誘導(dǎo)，在37ku左右出現(xiàn)特異性蛋白表達(dá)條帶（圖4），說明AK基因在其中成功表達(dá)。

圖3 PCR鑒定結(jié)果Fig.3 Identification of colony PCR

圖4 SDS－PAGE電泳圖Fig.4 The picture of SDS－PAGE

2.3 實時熒光定量PCR

通過實時定量PCR擴(kuò)增，得到內(nèi)參基因和AK基因的系列模板量和Ct值線性關(guān)系的標(biāo)準(zhǔn)曲線及其主要參數(shù)（圖5）。從圖5可以看出，AK的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：y＝－0.297x＋11.414，曲線的斜率為－0.297，相關(guān)系數(shù)為0.995。分別對16SrRNA、石河子田間品系A(chǔ)K、敏感品系A(chǔ)K的表達(dá)情況進(jìn)行實時檢測，表明石河子田間品系棉鈴蟲體內(nèi)AK基因的表達(dá)量明顯高于敏感品系棉鈴蟲體內(nèi)AK基因的表達(dá)量。

圖5 16SrRNA的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.5 Standard curve of 16SrRNA

圖6 AK的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.6 Standard curve of AK

3 討論

精氨酸激酶屬于磷酸原激酶家族中的重要一員，起著類似于脊椎動物中肌酸激酶的作用，是一個與細(xì)胞內(nèi)能量運轉(zhuǎn)、肌肉收縮、ATP再生有直接關(guān)系的重要激酶，AK是節(jié)肢動物和軟體動物中的唯一磷酸原激酶，在昆蟲肌肉中，磷酸精氨酸是唯一有效的形成ATP的磷酰基供體，能在一定時間內(nèi)為激烈運動的肌肉提供能量，同時又維持ATP的恒定水平。

在無脊椎動物體內(nèi)，大多數(shù)精氨酸激酶均為組成型表達(dá)，表達(dá)范圍廣。由于精氨酸激酶與能量代謝密切相關(guān)，所以表達(dá)存在時空特異性，主要集中在大量需能的組織中。通過熒光定量PCR對凡納濱對蝦精氨酸激酶的表達(dá)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)其表達(dá)分布很廣，肌肉中表達(dá)量最高，而表皮中表達(dá)量最低［10－11］。在某些生物的生命史中，其表達(dá)量也有很大差異。在家蠶的生命周期中，隨著齡期的增長，精氨酸激酶的表達(dá)量呈明顯上升趨勢，到熟蠶期達(dá)到最大，在蛹期表達(dá)量逐漸降低。通過基因上游轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點及發(fā)育表達(dá)模式分析，家蠶精氨酸激酶基因的表達(dá)可能受蛻皮激素調(diào)控［12］。此外，研究還表明精氨酸激酶與果蠅早期的蛻皮激素有一定的關(guān)系［13］。精氨酸激酶的表達(dá)不僅具有時空特異性，還具有分工與性別的區(qū)別。紅螞蟻體內(nèi)，精氨酸激酶的表達(dá)及蛋白活性順序如下：工蟻＞有翅的雌成蟲＞有翅的雄成蟲＞幼蟲＞工蟻蛹≈有翅蛹。在雌性有翅的紅螞蟻與工蟻體內(nèi)，精氨酸激酶活性均是頭部和胸部高于腹部；在雄性有翅的紅螞蟻體內(nèi)，在頭部與腹部精氨酸激酶的表達(dá)量比胸部高［14］。精氨酸激酶與能量利用及再生有緊密聯(lián)系，可以由此推斷生物體內(nèi)的需能關(guān)系，進(jìn)一步應(yīng)用到害蟲的防治中。

在大腸桿菌BL21表達(dá)棉鈴蟲AK蛋白，SDSPAGE電泳表明，棉鈴蟲AK成功的在原核細(xì)胞中得到表達(dá)，對AK的表達(dá)調(diào)控以及蛋白質(zhì)水平的進(jìn)一步研究和更好地探討該基因與棉鈴蟲抗性與防治的相關(guān)機(jī)制等奠定了基礎(chǔ)；并可在此基礎(chǔ)上研究精氨酸激酶基本酶學(xué)性質(zhì)，為開發(fā)以精氨酸激酶為靶標(biāo)的新型害蟲抑制劑提供理論依據(jù)。同時，本研究通告實時熒光定量PCR技術(shù)來研究AK基因在不同棉鈴蟲品系間表達(dá)量的差異，經(jīng)過對石河子地區(qū)田間品系棉鈴蟲與敏感品系棉鈴蟲體內(nèi)AK基因表達(dá)量分析，可推測石河子品系棉鈴蟲的生命代謝活動的能力要強于敏感品系棉鈴蟲的生命代謝的能力，從而為研究不同品系棉鈴蟲對外界環(huán)境適應(yīng)能力，抗藥性等方面提供重要依據(jù)。

［1］Perovic Ottstadt S，Wiens M，Schroder H C，et al.Argi－nine kinase in the demosponge Suberitesdomuncula：regulation of its expression and catalytic activity by silicic acid［J］.Exp Biol，2005，208：637－646.

［2］Tanaka K，Suzuki T.Role of amino－acid residue 95in substrate specificity of phosphagen kinases［J］.FEBSLett，2004，573：78－82.

［3］Holt S M，Kinsey S T.Osmotic effects on arginine kinase function in living muscle of the blue crab Callinectes sapidus［J］.Exp Biol，2002，205：1775－1785.

［4］Kenyon G L，Reed G H.Creatine kinase：structure－activity relationships［J］.Adv Enzymol，1983，54：367－426.

［5］Freddi Isaac Zuniga，Gina H，Ochoa Shannon D，et al.S－crystallin and arginine kinase bind F－actin in light－anddark－adapted octopus retinas［J］.Current Eye Research，2004，28：343－350.

［6］Speed S R，Baldwin J，Wong R J，et al.Metabolic characteristics of muscles in the spiny lobster，Jasus edwardsii，and responses to emersion during simulated live transport［J］.Comp Biochem Physiol B Biochem Mol Biol，2001，128：435－444.

［7］Edmiston P L，Schavolt K L，Kersteen E A，et al.Creatine kinase：a role for arginine－95in creatine binding and active site organization［J］.Biochim.Biophys Acta，2001，1546，38：291－298.

［8］Schneider A，Wiesner R J，Grieshaber M K.On the role of arginine kinase in insect flight muscle［J］.Insect Biochem，1989，19：471－480.

［9］朱雯靜.蝗蟲精氨酸激酶的活性中心及其抑制劑研究［D］.濟(jì)南：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)，2008.

［10］Yao C，Ji P，Kong P，et al.Arginine kinase fromLitopenaeus vannamei：cloning，expression and catalytic properties［J］.Fish ＆Shellfish Immunology，2009，26：553－558.

［11］姚翠鸞，冀培豐，孔鵬，等.凡納濱對蝦精氨酸激酶的多克隆抗體制備及組織特異性表達(dá)分析［J］.水產(chǎn)學(xué)報，2009，33（6）：1026－1030.

［12］王華兵，徐豫松.家蠶精氨酸激酶基因的克隆、基因結(jié)構(gòu)與表達(dá)分析［J］.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2006，39（11）：2354－2361.

［13］Collier G，James J.Arginine kinase and pyruvate kinase are coordinately controlled by the 75B″early″gene in Drosophila imaginal discs［J］.Genetics，1987，116：12.

［14］Wang H，Zhang L，Zhang L，et al.Arginine kinase：Differentiation of gene expression and protein activity in the red imported fire ant，Solenopsis Invicta［J］.Gene，2009，430：8－43.