常欣峰,宋春花,羅寶英,羅亞楠,李 歡,黃志華,韓立民*

(1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，長(zhǎng)沙 410007；2.贛南醫(yī)學(xué)院，江西 贛州 341000)

腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移與機(jī)體的免疫狀態(tài)密切相關(guān)。研究[1-2]表明，腫瘤患者都會(huì)出現(xiàn)不同程度的免疫功能下降現(xiàn)象,如NKC活性、CD4+/CD8+比值、IL-2含量等均呈下降趨勢(shì)，這是腫瘤得以無(wú)限增長(zhǎng)的一個(gè)重要因素。而腫瘤的生長(zhǎng)又通過(guò)分泌免疫抑制因子進(jìn)一步抑制宿主免疫功能，從而形成惡性循環(huán)[3]。近年來(lái),腫瘤的生物治療得到長(zhǎng)足的發(fā)展，在改善患者生存質(zhì)量，降低復(fù)發(fā)率方面的重要作用已得到越來(lái)越多的認(rèn)可和重視。腫瘤的生物治療成為繼手術(shù)、放療、化療之后的第四大治療方法。目前國(guó)內(nèi)外有關(guān)腫瘤生物治療包括：免疫調(diào)節(jié)劑治療、腫瘤細(xì)胞瘤苗治療、過(guò)繼性T細(xì)胞治療-CIK、樹(shù)突細(xì)胞疫苗治療和造血干細(xì)胞移植治療等五大方法。筆者通過(guò)對(duì)已上市疫苗進(jìn)行的篩選研究，確定了多價(jià)疫苗應(yīng)用的處方(HIS)，并申請(qǐng)了中國(guó)發(fā)明專(zhuān)利(申請(qǐng)?zhí)枺?00810107096.6)。在前期工作中，已完成對(duì)HIS急性和3個(gè)月長(zhǎng)期毒性實(shí)驗(yàn)的觀察。本次實(shí)驗(yàn)以S180肉瘤小鼠為模型，通過(guò)計(jì)算脾指數(shù)、抑瘤率及檢測(cè)IL-6、IL-10，初步探討HIS對(duì)免疫系統(tǒng)的影響及抑瘤機(jī)理。

1 材料

1.1 動(dòng)物及瘤株 SPF級(jí)昆明小鼠40只，雄性，6～8周齡，體質(zhì)量18～22 g,由湖南省斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，許可證號(hào)：SCXK(湘)2009-0004，合格證號(hào),4300016645。S180瘤株，由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)藥研究所購(gòu)進(jìn)，贛南醫(yī)學(xué)院科研中心傳代培養(yǎng)。

1.2 藥品及試劑 高效免疫調(diào)節(jié)劑(HIS)，由江中腫瘤治療研究組提供，批號(hào)：110325;環(huán)磷酰胺，白色粉狀針劑，0.2 g/支，江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司生產(chǎn)，批號(hào)：12041125；IL-6放免檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北京普爾偉業(yè)生物科技有限公司，批號(hào)：20120820;IL-10多克隆抗體購(gòu)自博士德生物工程有限公司(貨號(hào):BA1201)；BCA蛋白定量試劑盒購(gòu)自天根生化科技有限公司(貨號(hào)：A：Lot#J9122；B：Lot#J8830)。

1.3 儀器 SN-695型智能放免γ測(cè)量?jī)x(上海核福光電儀器有限公司),賽多利斯BS224S型電子天平(北京賽多利斯儀器有限公司)，MK3型酶標(biāo)儀(美國(guó)Thermo公司)。垂直電泳儀(美國(guó)Bio-Rad公司)，化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)(美國(guó)Bio-Rad公司)。

2 方法

2.1 S180肉瘤小鼠模型的建立 于超凈工作臺(tái)，無(wú)菌條件下抽取接種S180瘤株7 d的小鼠腹水，呈淡奶白色，生理鹽水稀釋后,1 000 r/min，離心5 min，棄上清液，用生理鹽水將細(xì)胞重懸，苔盼藍(lán)染色，腫瘤活細(xì)胞比率>95%，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×107個(gè)/mL，置于冰水中保存。75%乙醇消毒,0.2 mL/只接種于小鼠右腋部皮下，正常對(duì)照組接種同體積的生理鹽水。

2.2 分組及給藥 接種后次日，將40只小鼠隨機(jī)分為4組,即正常對(duì)照組、S180肉瘤模型組、S180肉瘤模型加環(huán)磷酰胺組(CTX組)、S180肉瘤模型加高效免疫調(diào)節(jié)劑組(HIS組)，每組10只。CTX組于小鼠腹腔注射CTX，50 mg/kg；HIS治療組給予腹股溝皮下注射濃度為0.03 g/mL的HIS 0.1 mL/10 g體質(zhì)量,終劑量為0.3 g/kg；正常對(duì)照組及S180肉瘤模型組腹腔注射等容積生理鹽水。以上各組均3 d給藥1次。連續(xù)10 d(即給予4次藥物治療)。

2.3 瘤重、抑瘤率及脾指數(shù)測(cè)定 于末次給藥24 h后，稱(chēng)體質(zhì)量，取血，取脾臟、腫瘤，電子天平稱(chēng)脾臟及腫瘤質(zhì)量。

2.4 放射免疫學(xué)方法檢測(cè)血清IL-6水平 摘眼球取血置于促凝管中，4 ℃、3 000 r/min，離心10 min，制備血清，-80 ℃保存。送往北京普爾偉業(yè)生物科技有限公司代檢。

2.5 Western blot法檢測(cè)腫瘤組織細(xì)胞因子IL-10表達(dá) 于-80 ℃冰箱中稱(chēng)取腫瘤組織20～30 mg，以預(yù)冷的PBS清洗并用眼科剪將組織剪碎于1.5 mL EP管中，再加入適量的蛋白裂解液研磨，4 ℃顛倒混勻1 h，12 000 r/min，離心5 min，抽取上清液，即為組織總蛋白，用BCA蛋白檢測(cè)法進(jìn)行蛋白定量。取50 μg蛋白，調(diào)整體積為24 μL，樣品煮沸5 min，6 000 r/min，離心5 min，經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳，濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移至NC膜，5%脫脂牛奶封閉1 h，1∶200稀釋的IL-10一抗,4 ℃孵育過(guò)夜；TBST洗3次，每次5 min；1∶1 000稀釋的二抗，室溫孵育l h，TBST洗3次，每次10 min；用ECL發(fā)光劑室溫孵育l min，化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)照相，體積法測(cè)定各條帶的光密度值。同樣方法測(cè)定β-actin的光密度值,各條帶IL-10與相應(yīng)β-actin的光密度值比值為該條帶的相對(duì)光密度值。各組取3只小鼠的樣本，重復(fù)試驗(yàn)3次,每次以模型組條帶相對(duì)光密度值為1進(jìn)行數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化，所得9次數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

3 結(jié)果

3.1 HIS對(duì)S180肉瘤小鼠瘤重、抑瘤率及脾指數(shù)的影響 見(jiàn)表1。

表1 HIS對(duì)S180肉瘤小鼠瘤重、抑瘤率及脾指數(shù)的影響(±s,n=10)

3.2 HIS對(duì)S180肉瘤小鼠血清IL-6水平的影響 見(jiàn)圖1。

注：與正常對(duì)照組比較，##P<0.01；與腫瘤模型組比較，△△P<0.01；與CTX組比較，▲▲P<0.01。

3.3 HIS對(duì)S180肉瘤小鼠腫瘤組織細(xì)胞因子IL-10表達(dá)的影響 見(jiàn)圖2。

注：與腫瘤模型組比較，##P<0.01；與CTX組比較，△△P<0.01。

4 討論

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,HIS可明顯抑制S180肉瘤的生長(zhǎng)，同時(shí)小鼠的脾指數(shù)升高，提示HIS可通過(guò)提高機(jī)體的免疫功能起到抗腫瘤作用。

免疫機(jī)制的失能是腫瘤形成的重要因素。其中Th1/Th2細(xì)胞的平衡向Th2細(xì)胞漂移是腫瘤免疫機(jī)制失能的主要表現(xiàn)之一。Thl類(lèi)細(xì)胞分泌IL-2、INF-γ和TNF-β等細(xì)胞因子，是機(jī)體抗癌、抗病毒的主要參與者；Th2類(lèi)細(xì)胞分泌IL-4、IL-6和IL-l0等細(xì)胞因子,在體內(nèi)可抑制免疫應(yīng)答[4]。而腫瘤宿主處于Th2細(xì)胞因子優(yōu)勢(shì)狀態(tài)是腫瘤免疫逃逸的機(jī)理之一。IL-6是一種多效應(yīng)的細(xì)胞因子，也是重要的免疫抑制因子[5]，主要由淋巴細(xì)胞、激活的巨噬細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生。IL-6與多種腫瘤發(fā)生、發(fā)展關(guān)系密切,它通過(guò)干預(yù)細(xì)胞的黏附性、血栓形成、腫瘤特異性抗原的表達(dá)及腫瘤細(xì)胞的增值從而影響腫瘤的進(jìn)展[6]。IL-10作為重要的免疫抗炎因子,也被稱(chēng)為人類(lèi)細(xì)胞因子合成抑制因子。它能抑制T細(xì)胞的增殖分化，抑制單核細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞的生物活性，抑制Th1細(xì)胞產(chǎn)生IL-2、INF-γ等,從而下調(diào)機(jī)體的抗腫瘤反應(yīng)[7-9]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，HIS可明顯降低小鼠外周血IL-6水平，降低腫瘤組織中IL-10表達(dá)。提示HIS可抑制腫瘤形成過(guò)程中Th1/Th2細(xì)胞的平衡向Th2細(xì)胞漂移，減輕腫瘤機(jī)體的免疫機(jī)制的失能，從而有效抑制腫瘤的生長(zhǎng)。

綜上所述，HIS可提高機(jī)體免疫功能并有抑瘤效果。作用機(jī)理可能與HIS降低了免疫抑制因子IL-6、IL-10表達(dá)水平，抑制Th1/Th2細(xì)胞平衡向Th2細(xì)胞漂移有關(guān)。從而為進(jìn)一步在臨床推廣和使用HIS提供了理論依據(jù)。

[1]楊威,曹春霞,劉青光,等.自體腫瘤瘤苗對(duì)荷瘤鼠Th1、Th2型細(xì)胞因子及細(xì)胞毒作用的影響[J].腫瘤,2005,25(3):205-207.

[2]林卡莉,徐鷹,黃志華,等.香菇多糖對(duì)荷瘤鼠白細(xì)胞介素-2和白細(xì)胞介素-6表達(dá)及腫瘤細(xì)胞周期影響的研究[J].時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥,2010,21(6):1436-1437.

[3]侯立男,何向輝,章志翔.細(xì)胞因子基因治療腫瘤的現(xiàn)狀和展望[J].臨床和實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志,2008,7(1):145-147.

[4]任蕊,趙金茹,連媛媛,等.膈下逐瘀湯聯(lián)合環(huán)磷酰胺對(duì)Hca-f肝癌小鼠抗腫瘤作用的實(shí)驗(yàn)研究[J].吉林中醫(yī)藥,2010,30(3):257-259.

[5]寇小格,Liu M Y.細(xì)胞因子與腫瘤臨床表現(xiàn)及轉(zhuǎn)歸的關(guān)系[J].國(guó)際腫瘤學(xué)雜志,2010,37(3):188-190.

[6]王治偉,遲瓊,萬(wàn)利.乳腺癌患者血清IL-6、IL-8、IL-10和TNF-α的水平變化及臨床意義[J].廣州醫(yī)藥,2012,43(3):45-47.

[7]黃愛(ài)民,陳方,林卡莉.香菇多糖對(duì)荷瘤鼠血清IL-10、TNF-和腫瘤DC表達(dá)的影響[J].時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥,2012,23(3):665-666.

[8]王欣,趙化榮,顧霞,等.血漿白細(xì)胞介素6和10水平與不同類(lèi)型淋巴瘤的關(guān)系及其臨床意義[J].南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2011,31(8):1360-1364.

[9]Boyano MD,Garcia-Vázquez MD,López-Michelena T,et al.Soluble interleukin-2 receptor,intercellular adhesion molecule-1 and interleukin-10 serum levels in patients with melanoma[J].Br J Cancer,2000,83(7):847-852.