王玉榮，金玉蘭 *，樸美子，任 航

（1.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)化學(xué)與藥學(xué)院，山東 青島 266109；2.青島農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程院，山東 青島 266109；3.青島橙果環(huán)?？萍及l(fā)展有限公司，山東 青島 266101）

山楂別名山里紅、酸棗，薔薇科，山楂屬，主要分布在我國(guó)的山東、河南、山西、河北、遼寧等地，具有很高的食用及藥用價(jià)值。山楂的主要成分為多糖，并且主要以果膠的形式存在。近年來，多糖因其營(yíng)養(yǎng)、醫(yī)療保健等功能以及無毒、無副作用，受到國(guó)內(nèi)外學(xué)者的關(guān)注，從各種生物材料中尋找與提取具有一定生理活性的多糖成分的研究十分活躍[1]。ENRIQUE G等[2]從海草中提取出海藻多糖，并對(duì)化學(xué)組分進(jìn)行了分析。唐禮可[3]通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)山楂多糖具有顯著的抗疲勞作用。閆啟光[4]將山楂多糖進(jìn)行小鼠實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)山楂能增強(qiáng)小鼠的免疫力。杜麗娟等[5]對(duì)果膠進(jìn)行分解后，測(cè)定分解物有抗氧化能力。戴遠(yuǎn)臣等[6]對(duì)山楂多糖的提取工藝進(jìn)行了優(yōu)化，證實(shí)山楂多糖對(duì)保多利亞乳桿菌的生長(zhǎng)有促進(jìn)作用。本研究以山楂果肉和山楂整果為原料，分別在4℃、50℃、100℃條件下提取山楂多糖，研究了山楂果肉、全果在不同提取溫度時(shí)多糖的提取率、黏度以及蛋白質(zhì)、還原糖、中性多糖、酸性多糖的含量及其抗氧化性，為山楂工業(yè)化綜合應(yīng)用提供了依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鮮山楂：購(gòu)于青島城陽大潤(rùn)發(fā)超市；牛血清標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)樣品：原平皓（天津）生物技術(shù)有限公司；考馬斯亮藍(lán)G-250、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）：美國(guó)Sigma公司；咔唑：阿拉丁試劑（上海）有限公司；無水乙醇、濃硫酸、葡萄糖、3，5-二硝基水楊酸（dinitrosalic acid，DNS）、酒石酸鈉、苯酚，均為國(guó)產(chǎn)分析純（AR）試劑。

1.2 儀器與設(shè)備

THZ-82型恒溫振蕩器、CU-600B型電熱恒溫水浴鍋：上海?，攲?shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；TGL-16M型高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)：長(zhǎng)沙湘儀儀器有限公司；RE-52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)議：上海亞榮生化儀器廠；FD-ID-80冷凍干燥機(jī)：北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；NDJ-1型旋轉(zhuǎn)黏度計(jì)：上海昌吉地質(zhì)儀器有限公司；WH-2微型旋渦混合儀：上海滬西分析儀器廠有限公司；DU-800型紫外分光光度計(jì)：美國(guó)貝克曼公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 山楂中多糖的提取[7]

新鮮山楂蒸餾水清洗，晾干表面水分，將一部分去除果核。分別稱取山楂全果和果肉各50g，加入10倍體積的蒸餾水，4℃、50℃、100℃分別水浴振蕩（120r/min）提取6h、3h、3h后，提取液6000r/min離心10min，保留上清液。殘?jiān)聪嗤椒ㄔ偬崛?次，合并3次上清液。

將提取液濃縮至1/2體積，加入2倍體積95%vol乙醇，室溫條件下靜置2h，6000r/min離心5min，得粗多糖沉淀，用95%vol乙醇洗2次，冷凍干燥，山楂中粗多糖的提取率按下式計(jì)算：

1.3.2 黏度的測(cè)定

1.3.3 蛋白質(zhì)含量測(cè)定

山楂中蛋白質(zhì)含量的測(cè)定采用Bradford法[8]。以牛血清蛋白（bouine serum albumin，BSA）標(biāo)準(zhǔn)溶液繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，在波長(zhǎng)595nm處測(cè)吸光度值，BSA濃度（μg/mL）為橫坐標(biāo)，吸光度值（OD）為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見圖1。配制濃度為10mg/mL的多糖溶液，取100μL樣品，加1mL考馬斯亮藍(lán)工作液，混勻，靜置2min，在波長(zhǎng)595nm處測(cè)吸光度值，參照標(biāo)準(zhǔn)曲線得出蛋白質(zhì)含量。

圖1 蛋白質(zhì)含量測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 The standard curve of determination of protein content

1.3.4 還原糖的含量測(cè)定

DNS法[9]測(cè)定還原糖含量。稱取185g酒石酸鉀鈉溶于500mL蒸餾水，溫?zé)崛芙?，再加?.5g的3，5-二硝基水楊酸和262mL氫氧化鈉（2mol/L）溶液，溶解后加入5g苯酚和5g亞硫酸鈉，攪拌溶解。冷卻后加蒸餾水定容至1000mL，配制成DNS試劑貯存于棕色瓶中（暗處保存7d～10d）備用。將葡萄糖經(jīng)105℃干燥至質(zhì)量恒定，準(zhǔn)確稱取200mg蒸餾水溶解，于200mL容量瓶中定容，得1mg/mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液。以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)液繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見圖2。取500μL的2mg/mL多糖溶液，加入DNS試劑500μL，搖勻，沸水浴5min，流水冷卻，加4mL蒸餾水，混勻，在波長(zhǎng)540nm處測(cè)吸光度值。

圖2 還原性含量測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 The standard curve of determination of reducing sugar content

1.3.5 中性多糖的測(cè)定

用改良的苯酚-硫酸法[10]測(cè)定山楂多糖中中性多糖的含量。精密量取0、0.2mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL、1.0mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液于具塞試管中，加蒸餾水至2mL，再加入5%苯酚1mL，搖勻，迅速加入5mL硫酸，搖勻，放置15min，沸水浴10min，迅速冷卻至室溫，在波長(zhǎng)490nm處測(cè)吸光度值，得中性多糖含量（x）與吸光度值（y）關(guān)系的線性回歸方程：y=0.0059x+0.0038，R2=0.9991。取400μL 1mg/mL的多糖溶液，補(bǔ)蒸餾水至2mL，再加入5%苯酚1mL，迅速加入5mL硫酸，混勻，靜置15min，沸水浴10min，迅速冷卻至室溫，在波長(zhǎng)490nm處測(cè)吸光度值。

圖3 中性多糖含量測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.3 The standard curve of determination of neutral polysaccharides content

1.3.6 酸性多糖的測(cè)定

酸性多糖的測(cè)定采用硫酸-咔唑法[11]。多糖經(jīng)水解生成己糖醛酸，在強(qiáng)酸中與咔唑試劑發(fā)生縮合反應(yīng)，生成紫紅色化合物，產(chǎn)生紫外吸收，且在一定濃度范圍內(nèi)，其呈色強(qiáng)度與己糖醛酸含量成正比。稱取Na2B4O7·10H2O 0.478g，溶于100mL硫酸溶液中，配制成四硼酸鈉-濃硫酸溶液。以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)溶液，在波長(zhǎng)530nm處測(cè)吸光度值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線：y=0.001x+0.1442，R2=0.9965。取1mg/mL多糖溶液200μL于具塞試管，加蒸餾水至500μL，再加入四硼酸鈉-硫酸溶液2.5mL，搖勻，沸水浴20min，迅速冷卻至室溫，加入0.15%咔唑，室溫避光2h，在波長(zhǎng)530nm處測(cè)吸光度值。

會(huì)上，廳機(jī)關(guān)、退休老干部、先進(jìn)單位和先進(jìn)個(gè)人代表亓文輝、姜清春、李明啟、高永福、吳慶剛、于學(xué)峰、王吉貴、許錫寧、常林春作了發(fā)言。

1.3.7 DPPH自由基清除能力的測(cè)定

配制濃度為1mg/mL的山楂多糖溶液，用蒸餾水作空白，分別向樣品管、樣參管內(nèi)加樣品溶液500μL，樣品管和對(duì)照管各加1×10-4mol/L DPPH試劑2.4mL，樣參管加無水乙醇2.4mL，全部加水至4mL，充分混勻后，室溫黑暗處靜置反應(yīng)30min，在波長(zhǎng)517nm處測(cè)吸光度值，按式（2）計(jì)算山楂多糖對(duì)DPPH自由基的清除率。

圖4 酸性多糖含量測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.4 The standard curve of determination of acidic polysaccharidescontent

式中：A樣參、A樣品、A對(duì)照分別表示對(duì)照管和樣品管的吸光度值。

1.3.8 羥自由基（·OH）清除能力的測(cè)定

采用鄰二氮菲-Fe2+法進(jìn)行羥自由基（·OH）清除能力的測(cè)定，并參照KIM JH 等[12]的方法進(jìn)行改良。蒸餾水為空白，分別向未損傷管、損傷管、樣參管中加入水1.25mL、1mL、0.75mL，樣參管和樣品管各加樣品1mL，未損傷管、損傷管、樣品管中各加7.5×10-3mol/L鄰二氮菲0.25mL，向4個(gè)管中各加1.5×10-4mol/L磷酸緩沖液（pH7.4）3.25mL后，充分混勻，向未損傷管、損傷管、樣品管中加入7.5×10-4mol/L FeSO40.25mL，迅速混勻，損傷管和樣品管加入0.1%H2O20.25mL，37℃水浴90min，在波長(zhǎng)536nm處測(cè)吸光度值，并按照式（3）計(jì)算羥自由基清除率。

式中：A未損傷、A損傷、A樣品、A樣參分別表示未損傷管、損傷管、樣品管、樣參管的吸光度值。

2 結(jié)果與討論

2.1 提取溫度對(duì)多糖提取效果的影響

溫度對(duì)多糖提取效果的影響見圖3。在4℃、50℃和100℃條件下對(duì)新鮮的山楂果肉、全果提取多糖時(shí)，100℃時(shí)多糖得率最高，山楂果肉、全果多糖得率分別達(dá)到3.72%、3.65%，說明山楂中多糖基本存在于果肉中。50℃時(shí)，提取率分別為2.37%、2.78%。4℃提取山楂多糖得率最低為2.05%、2.17%。這可能由于溫度升高，多糖的溶解度增大或者高溫破壞了山楂的組織結(jié)構(gòu)，使多糖更易溶出。李艷紅[13]用微波提取鮮山楂中多糖40min，提取率為2.06%；劉巧利等[14]加14倍體積的水，并浸泡1h，加熱回流3h，提取多糖的最高得率為3.8%，方法相對(duì)復(fù)雜，成本高，且黃酮得率達(dá)到2.56%，多糖得率僅高出0.08%。

圖5 不同溫度提取山楂果肉、全果多糖的提取率比較Fig.5 Comparison of the extraction yields of hawthorn polysaccharides by different extraction temperature

2.2 提取溫度對(duì)山楂多糖黏度的影響

提取溫度對(duì)山楂多糖黏度的影響見圖4。隨著提取溫度的升高，山楂果肉和全果提取的多糖黏度均降低。在多糖濃度相同時(shí)，山楂果肉和全果提取的多糖黏度并無顯著差異。當(dāng)多糖濃度為10mg/mL時(shí)，在室溫條件下測(cè)多糖的黏度，4℃提取果肉、全果多糖黏度分別是166mPa·s、158mPa·s，100℃提取時(shí)最低分別為38mPa·s、30mPa·s。多糖分子質(zhì)量、分子的構(gòu)造與支鏈的個(gè)數(shù)等都影響多糖的黏度[15]。在相同提取溫度時(shí)，以山楂果肉和全果為原料水提的多糖黏度相近。本實(shí)驗(yàn)中不同溫度提取多糖黏度有明顯的差異，這可能是由于冷水、熱水可溶性多糖本身性質(zhì)的不同，或者是提取溫度的升高引起多糖性質(zhì)的改變。

圖6 不同溫度提取山楂果肉、全果多糖的黏度比較Fig.6 Comparison of the viscosity of hawthorn polysaccharides by different extraction temperature

2.3 提取溫度對(duì)山楂多糖化學(xué)成分的影響

不同溫度條件下提取的山楂多糖的化學(xué)成分見表1。隨著溫度的升高，多糖中的蛋白質(zhì)含量下降，提取溫度為4℃時(shí)，山楂果肉和山楂果中的蛋白質(zhì)含量為4.78%和4.60%，當(dāng)溫度提高為100℃時(shí)蛋白質(zhì)含量分別降為3.50%和3.57%。山楂多糖中還原糖的量隨著溫度的升高而升高，相反，中性多糖和酸性多糖含量隨著溫度的升高而下降。因此，可以推測(cè)山楂的提取過程中隨著溫度的變化其多糖成分的結(jié)構(gòu)級(jí)分子質(zhì)量可能發(fā)生了改變，從而引起其還原糖量增加，中性多糖和酸性多糖的含量下降。

表1 不同溫度提取山楂多糖的化學(xué)特性Table 1 The chemical properties of hawthorn polysaccharides by different extraction temperature

2.4 提取溫度對(duì)山楂多糖DPPH自由基和·OH自由基清除能力的影響

圖7 提取溫度對(duì)山楂果肉、全果多糖DPPH清除率的影響Fig.7 Effects of different extraction temperature on DPPH radical scavenging activity of hawthorn polysaccharides

圖8 提取溫度對(duì)多糖·OH清除率的影響Fig.8 Effects of extraction temperature on hydroxyl radical scavenging capacity of hawthorn polysaccharides

提取溫度對(duì)山楂多糖DPPH自由基和·OH自由基清除能力的影響見圖7、圖8。4℃提取的山楂多糖對(duì)自由基的清除能力最高，多糖濃度為1mg/mL時(shí)，山楂果肉、全果多糖的DPPH自由基清除能力分別為39.7%、44.2%，對(duì)·OH自由基的清除能力分別為26.1%、14.9%。100℃提取的山楂多糖對(duì)DPPH自由基的清除能力最低，分別為16.8%、18.8%，對(duì)·OH自由基的清除能力分別為19.9%、13.0%。這表明山楂核中含有影響山楂多糖抗氧化能力的成分，可提高山楂多糖清除DPPH自由基的能力。王振斌等[16]對(duì)超聲波提取的無花果多糖的抗氧化性進(jìn)行了研究發(fā)現(xiàn)，無花果多糖濃度為0.2%時(shí)，對(duì)·OH自由基的最高清除率為30.3%。杜麗娟等[17]對(duì)山楂果膠酶解物進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，其在1.0%濃度條件下對(duì)DPPH自由基清除率甚至達(dá)到100%，為天然食品抗氧化劑及抗氧化食品的開發(fā)提供了依據(jù)。

3 結(jié)論

本研究將山楂果肉與整果分開提取多糖，研究表明山楂中的多糖主要存在于果肉中。從新鮮山楂果肉、全果中提取的粗多糖呈淡黃色，不溶于乙醇，難溶于冷水，易溶于熱水，對(duì)DPPH自由基有很高清除能力，表現(xiàn)出一定的抗氧化性。100℃提取時(shí)，得率最高分別為3.72%和3.65%，4℃提取的多糖黏度最高，多糖溶液為10mg/mL時(shí)，山楂果肉、全果的黏度分別是166mPa·s 和158mPa·s，多糖濃度為1mg/mL時(shí)，山楂多糖對(duì)DPPH自由基和·OH表現(xiàn)出一定的清除作用。隨著提取溫度的上升，山楂粗多糖中還原糖的量增加，相反中性多糖和酸性多糖含量降低，自由基清除能力下降。在相同提取溫度時(shí)，山楂果肉和山楂果的提取率和多糖成分無明顯的差異，但對(duì)其抗氧化能力有一定影響。

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