鄧毛程，王 瑤，李 靜，李億祥

（1.廣東輕工職業(yè)技術(shù)學(xué)院，廣東 廣州 510300；2.五華縣溢群酒業(yè)有限公司，廣東 梅州 514400）

我國南方擁有豐富的甘蔗資源，主要用于生產(chǎn)蔗糖、食用酒精及燃料酒精[1-2]。甘蔗不僅富含蔗糖，還含有豐富的維生素以及鐵、鈣、磷、錳、鋅等礦物質(zhì)元素[3-4]，并具有獨(dú)特的甘蔗清香，是釀造果酒的良好原料。以甘蔗原料釀造果酒，不僅對(duì)發(fā)酵產(chǎn)酒率有較高的要求，還要關(guān)注果酒的風(fēng)味。但是，在現(xiàn)有的甘蔗果酒發(fā)酵研究中，果酒往往存在香氣不足等問題，難以達(dá)到風(fēng)味要求，其主要根源在于缺乏甘蔗果酒釀造的專用酵母。因此，本實(shí)驗(yàn)從自然發(fā)酵的甘蔗渣中篩選適宜甘蔗果酒釀造的優(yōu)良酵母菌種，并初步研究其發(fā)酵特性，以便為甘蔗果酒發(fā)酵提供有用的菌種資源。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

篩選菌株：從自然發(fā)酵的、具有酒香的甘蔗渣中篩選獲得；對(duì)照菌株：釀酒酵母CICC1423（主要用于葡萄酒釀造），購自中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心。

自然發(fā)酵甘蔗渣、甘蔗汁由廣東省五華縣酒業(yè)有限公司提供；其他試劑均為市售。

富集培養(yǎng)基：蔗糖20g/L，酵母膏10g/L，蛋白胨10g/L，氯霉素100mg/L，用純凈水配制，調(diào)節(jié)pH值為5.0。

分離平板培養(yǎng)基：在富集培養(yǎng)基中加入2.3mg/L的孟加拉紅和20g/L的瓊脂。

斜面培養(yǎng)基：采用不加氯霉素、孟加拉紅的分離培養(yǎng)基。

甘蔗汁發(fā)酵培養(yǎng)基：用蔗糖調(diào)節(jié)甘蔗汁的糖度至200g/L，加入麥芽汁浸膏5g/L，根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要調(diào)節(jié)不同pH值。

所有培養(yǎng)基在121℃、20min條件下滅菌，冷卻備用。

1.2 儀器與設(shè)備

SPX-250恒溫培養(yǎng)箱：寧波江南儀器廠；ZHWY-100B恒溫?fù)u床：上海智城分析儀器制造有限公司；BV11-XQJSB血球計(jì)數(shù)板：上海市求精生化試劑儀器有限公司；RDY-SP1Z型核酸電泳儀：北京榮陽經(jīng)典科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 富集培養(yǎng)及平板初篩

在富集培養(yǎng)基中，接入10g經(jīng)自然發(fā)酵的甘蔗渣，置于28℃、200r/min的條件下振蕩培養(yǎng)20h，按10%的接種量，將富集培養(yǎng)液轉(zhuǎn)接入新鮮的富集培養(yǎng)基，于相同條件下振蕩培養(yǎng)20h。富集培養(yǎng)后，將培養(yǎng)液涂布在分離平板培養(yǎng)基上，置于28℃培養(yǎng)48h。參考文獻(xiàn)[5-6]提供的方法，根據(jù)典型酵母菌落特征，用無菌的竹簽挑取紅色菌落，接入斜面培養(yǎng)基，于28℃培養(yǎng)，菌苔長出后置于4℃保藏，備用。

1.3.2 甘蔗汁發(fā)酵復(fù)篩

首先，將平板初篩出來的各菌株斜面菌種和對(duì)照菌株斜面菌種接入甘蔗汁發(fā)酵培養(yǎng)基，在28℃、200r/min的條件下振蕩培養(yǎng)20h，用無菌水調(diào)整培養(yǎng)液酵母數(shù)至107CFU/mL，作為種子液；然后，按10%的接種量，將種子液接入新鮮的甘蔗汁發(fā)酵培養(yǎng)基，靜置發(fā)酵，至發(fā)酵液中乙醇濃度不再增加時(shí)結(jié)束，檢測發(fā)酵液的乙醇含量和總酯含量，感官評(píng)價(jià)發(fā)酵液的香氣，從而篩選出比較優(yōu)良的菌株。同時(shí)，對(duì)復(fù)篩菌株進(jìn)行分子鑒定。

1.3.3 起酵時(shí)間的比較

對(duì)上述復(fù)篩菌株和對(duì)照菌株進(jìn)行發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，每隔12h檢測CO2失重值，計(jì)算截至不同時(shí)間的CO2失重率，從而比較各菌株的起酵速度。CO2失重率的計(jì)算如下式：

1.3.4 耐乙醇特性的比較

在甘蔗汁發(fā)酵培養(yǎng)基中，分別用無水乙醇調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的乙醇含量為12%vol、14%vol、16%vol、18%vol，并用蔗糖調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的糖度為200g/L。制備復(fù)篩菌株和對(duì)照菌株的種子液，并以10%的接種量將種子液接入不同乙醇含量的培養(yǎng)基，于28℃、200r/min的條件下振蕩培養(yǎng)24h，檢測培養(yǎng)液中的酵母數(shù)，根據(jù)酵母數(shù)比較各菌株的耐乙醇特性。

1.3.5 優(yōu)選菌株的最適發(fā)酵溫度和最適發(fā)酵pH值

根據(jù)1.3.3和1.3.4的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，優(yōu)選出1株菌株。在不同溫度和不同起始pH值條件下，分別進(jìn)行靜置發(fā)酵，檢測發(fā)酵72h的乙醇含量，確定該菌株的最適發(fā)酵條件。

1.3.6 測定方法

采用Lane-Eynon法[7]測定還原糖含量；按國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T10345-2007《白酒分析方法》，采用酒精計(jì)法[8-9]測定發(fā)酵蒸餾液中的乙醇含量；采用回流皂化法[10-11]測定發(fā)酵液的總酯含量（以乙酸乙酯計(jì)）；采用稱重法[12-13]測定CO2失重值；采用血球計(jì)數(shù)板法[14]測定培養(yǎng)液中的酵母細(xì)胞數(shù)；由9位具有感官評(píng)價(jià)經(jīng)驗(yàn)的技術(shù)人員組成香氣評(píng)價(jià)小組，采用感官檢測方法對(duì)發(fā)酵液香氣進(jìn)行評(píng)價(jià)；參照文獻(xiàn)[15-16]提供的方法進(jìn)行DNA提取、PCR引物設(shè)計(jì)及PCR反應(yīng)，PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后，由深圳華大基因科技服務(wù)公司測序，將測序獲得的26S rDNA序列在美國國家生物技術(shù)信息中心（National Center of Biotechnology Information，NCBI）進(jìn)行Blastn相似序列檢索和分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌種的發(fā)酵復(fù)篩

根據(jù)菌落形態(tài)特征和顏色，從分離平板上挑取菌株102株。以發(fā)酵液中乙醇含量超過10%vol為發(fā)酵復(fù)篩的主要標(biāo)準(zhǔn)，從各菌株發(fā)酵結(jié)果中篩選出11株菌株。篩選適宜甘蔗果酒發(fā)酵的優(yōu)良菌株，不僅要求目標(biāo)菌株具有較高的產(chǎn)酒精能力，還要求所釀制的甘蔗果酒具有良好的風(fēng)味，故需從發(fā)酵液的乙醇產(chǎn)量、總酯產(chǎn)量及香氣等方面對(duì)各菌株進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)。11株菌株和對(duì)照菌株的發(fā)酵結(jié)果見表1。由表1可以看出，菌株G05、G19和G22的產(chǎn)酒精能力與對(duì)照菌株CICC 1423十分接近，其產(chǎn)酯能力和發(fā)酵液香氣均居待選菌株的前列，遠(yuǎn)高于對(duì)照菌株。因此，菌株G05、G19和G22可被確定為進(jìn)一步研究的菌株。同時(shí)，經(jīng)26S rDNA鑒定，菌株G05、G19、G22與登錄號(hào)為HM101471、GU080046、EU884435釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）的同源性都為99%，被鑒定為釀酒酵母。

表1 篩選菌株與對(duì)照菌株的發(fā)酵結(jié)果Table 1 Fermentation results of screening strains and contrasted strains

2.2 不同菌株的起酵時(shí)間

菌株G05、G19、G22和對(duì)照菌株在發(fā)酵過程中的CO2失重率變化情況見圖1。4株菌種的最終乙醇產(chǎn)量很接近，各時(shí)間段的CO2失重率可以反映出乙醇發(fā)酵的完成情況，而發(fā)酵前期的CO2失重率可以反映起酵時(shí)間的快慢。圖1表明，無論從任何時(shí)間去觀察，4株菌株CO2失重率的大小排序?yàn)镚05＞G19＞CICC1423＞G22。由于菌株G05的起酵時(shí)間最快，且CO2失重率達(dá)到100%的時(shí)間最短（僅需84h），故從起酵時(shí)間上可被確認(rèn)為優(yōu)良菌株。

圖1 不同菌株CO2失重率變化曲線Fig.1 Change curves of CO2 weigh loss of different strains

2.3 不同菌株的耐乙醇特性

在不同起始乙醇含量的培養(yǎng)基中，菌株G05、G19、G22和對(duì)照菌株CICC1423在生長24h的酵母細(xì)胞數(shù)見圖2。從圖2可以看出，隨著起始乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大，各菌株培養(yǎng)液的酵母細(xì)胞數(shù)呈下降的趨勢。起始的乙醇含量為12%vol～14%vol時(shí)，乙醇含量對(duì)各菌株生長影響不大；當(dāng)起始乙醇含量達(dá)到16%vol時(shí)，各菌株培養(yǎng)液的酵母細(xì)胞數(shù)均下降50%以上，表明16%vol的乙醇含量對(duì)各菌株生長有較明顯的抑制作用。從酵母細(xì)胞數(shù)可以確定菌株的耐乙醇特性，菌株G19、G22比對(duì)照菌株差，而菌株G05的耐乙醇特性與對(duì)照菌株十分相近，故可視為優(yōu)良菌株。

圖2 不同乙醇含量下酵母生長的細(xì)胞數(shù)量Fig.2 Effect of different ethanol content on cell number ofS.cerevisiae growth

2.4 優(yōu)選菌株的最適發(fā)酵溫度

將優(yōu)選菌株G05在不同的發(fā)酵溫度條件條件下發(fā)酵72h，乙醇產(chǎn)量見圖3。溫度是影響酵母生長和發(fā)酵作用的重要因素。由圖3看出，26℃～28℃范圍內(nèi)的乙醇產(chǎn)量較高，溫度過低或過高均不利于菌株G05的發(fā)酵作用。其中，當(dāng)發(fā)酵溫度為28℃時(shí)，乙醇產(chǎn)量達(dá)到最高，故確定菌株G05的最適發(fā)酵溫度為28℃。

圖3 不同溫度下的乙醇產(chǎn)量Fig.3 Effect of different fermentation temperature on yield of ethanol

2.5 優(yōu)選菌株的最適發(fā)酵pH值

將優(yōu)選菌株G05在不同的起始pH值條件下發(fā)酵72h，乙醇產(chǎn)量見圖4。在pH 4.5～5.5的范圍內(nèi)，乙醇產(chǎn)量較高，表明此pH值范圍有利于菌株G05的生長和發(fā)酵作用。其中，當(dāng)起始pH值為5.0時(shí)，乙醇產(chǎn)量達(dá)到最高，故可確定pH5.0為菌株G05的最適發(fā)酵pH值。

3 結(jié)論

從自然發(fā)酵甘蔗渣中篩選獲得1株優(yōu)良的酵母菌株G05，被鑒定為釀酒酵母。菌株G05最適的發(fā)酵溫度和發(fā)酵pH值分別為28℃和pH 5.0，發(fā)酵24h的CO2失重率可達(dá)20.4%，在含有16%vol乙醇的培養(yǎng)基能夠正常生長，在含糖200g/L的甘蔗汁培養(yǎng)基中的乙醇產(chǎn)量、總酯產(chǎn)量分別為10.8%vol和1.2g/L，具有起酵快、耐乙醇性較強(qiáng)、產(chǎn)酒率高、香氣明顯等特點(diǎn)。與對(duì)照菌株CICC1423相比，菌株G05更適用于甘蔗果酒發(fā)酵。但是，為了使該菌株能夠推廣應(yīng)用，仍需對(duì)菌株的其他特性和發(fā)酵工藝進(jìn)行深入研究。

圖4 不同pH值下的乙醇產(chǎn)量Fig.4 Effect of different initial pH value on yield of ethanol

[1]武曉娜，康富帥，閻銳鳴，等.低甲醇甘蔗酒的釀造工藝研究[J].現(xiàn)代食品科技，2012，28（6）：670-671.

[2]周世水，熊 建.甘蔗麥芽蒸餾酒釀酒工藝的研究[J].現(xiàn)代食品科技，2009，24（11）：1128-1129.

[3]李敏杰，熊 亞.甘蔗酒發(fā)酵條件的研究[J].寶雞文理學(xué)院學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2009，29（2）：43-46.

[4]方俊鵬，李 靜，鄧毛程，等.甘蔗汁風(fēng)味醋醋酸搖瓶發(fā)酵條件的研究[J].廣東輕工職業(yè)技術(shù)學(xué)院學(xué)報(bào)，2010，19（3）：14-17.

[5]趙祥杰，涂國全，肖更生，等.一株桑椹果酒酵母的分離篩選及耐性測定[J].釀酒科技，2007（1）：28-31.

[6]王 梅，張澎湃，帥桂蘭，等.TCC 在黃酒酵母選育中的應(yīng)用[J].釀酒，2001，28（5）：62-64.

[7]羅建成.生物工業(yè)分析[M].北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2009.

[8]曹新志，劉 芳，朱 茜.梨果酒酵母的篩選及發(fā)酵條件的研究[J].中國釀造，2010，29（5）：102-105.

[9]馬佩選.葡萄酒質(zhì)量與檢驗(yàn)[M].北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2002.

[10]廖永紅，沈 晗，石文娟.產(chǎn)香酵母碳源利用及發(fā)酵產(chǎn)香特性初步研究[J].食品與發(fā)酵工業(yè)，2010，36（2）：1-6.

[11]馬歌麗，張志剛，任秀麗.酯化紅曲霉菌液態(tài)培養(yǎng)條件研究[J].中國釀造，2007，26（8）：17-21.

[12]白雪蓮，岳田利，袁亞紅.優(yōu)良蘋果酒酵母的篩選研究[J].食品研究與開發(fā)，2006，27（3）：86-88.

[13]徐清萍，朱廣存.野生獼猴桃果酒酵母的篩選鑒定及耐受性的研究[J].中國釀造，2011，30（7）：120-123.

[14]周靜芳，肖冬光，許引虎，等.蘋果酒發(fā)酵中酵母菌株的篩選[J].釀酒科技，2006（8）：31-34.

[15]蘇艷秋，朱衛(wèi)華，吳 鵬，等.耐高溫、耐酸產(chǎn)酒精酵母的篩選與鑒定[J].微生物學(xué)雜志，2009，29（2）：43-47.

[16]常景玲，鄧小莉，王 斌，等.石榴果酒酵母的分離及發(fā)酵工藝[J].中國農(nóng)學(xué)通報(bào)，2010，26（20）：90-93.