饒發(fā)明, 林 希, 黃維哲 ，吳江渝*

(1. 武鋼集團(tuán)礦業(yè)有限公司烏龍泉礦，湖北 武漢 430213;2. 武漢工程大學(xué)材料科學(xué)與工程學(xué)院，湖北 武漢 430074)

0 引 言

抑制微生物生長和繁殖的工藝是水處理中非常重要的一環(huán)，直接決定了水質(zhì)及其使用范圍.傳統(tǒng)的水處理抗菌試劑主要是含氯氧化劑，如液氯、二氧化氯和氯胺等，這些抗菌試劑在殺菌的同時(shí)會與水中的微量有機(jī)物發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，生成三氯甲烷等具有高毒副作用的副產(chǎn)物，嚴(yán)重影響人體健康.因此，各種水處理抗菌劑被廣泛研究用以替代含氯試劑，如納米二氧化鈦材料[1]、納米金屬材料[2]、有機(jī)無機(jī)雜化材料[3-4]以及一些生物活性分子[5-6]等.超支化聚合物[7-8]是一類具有高度支化分子結(jié)構(gòu)以及大量末端官能團(tuán)的高分子化合物.這類化合物合成方法簡便，制備成本低廉，加上其獨(dú)特的分子結(jié)構(gòu)特性，是理想的水處理試劑基體，并已被用于絮凝脫色[9]及重金屬離子移除[10]的研究.

聚酰胺胺型超支化化合物[11-12]是超支化聚合物的重要類別，其末端具有大量的伯胺基團(tuán)，可以通過與細(xì)菌的細(xì)胞膜相互作用而抑制其生長繁殖，因此超支化聚酰胺胺化合物可用于抗菌試劑開發(fā).本研究選用乙二胺和丙烯酸甲酯為原料，首先反應(yīng)生成小分子預(yù)聚物，繼而通過逐步升溫使其聚合成具有高分子量和高度支化結(jié)構(gòu)的超支化聚酰胺胺化合物.以Hela細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)對象對合成的超支化化合物進(jìn)行了細(xì)胞毒性的測試.以大腸桿菌(革蘭氏陰性菌)和金黃葡萄球菌(革蘭氏陽性菌)為實(shí)驗(yàn)對象測試了超支化聚酰胺胺化合物的抗菌性能，以期為開發(fā)新型水處理抗菌試劑提供相關(guān)實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)及理論依據(jù).

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 原料

乙二胺(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn)，分析純，用前重蒸)，丙烯酸甲酯(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn)，分析純，用前重蒸)，Hela細(xì)胞由武漢大學(xué)化學(xué)與分子科學(xué)學(xué)院提供，大腸桿菌(Escherichiacoli)和金黃葡萄球菌(Staphylococcusaureus)均由華中師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院提供.

1.2 超支化聚酰胺胺的合成

10 g乙二胺溶于5 mL甲醇，緩慢滴加14.3 g丙烯酸甲酯，常溫?cái)嚢璺磻?yīng)，得到小分子預(yù)聚物.所得預(yù)聚物通過60，80，100，120，140 ℃逐步升溫，升溫過程采用油泵真空處理，得到黃色透明狀固體，用乙醚多次沉降后透析，經(jīng)冷凍干燥得到超支化聚酰胺胺化合物.合成路線如圖1所示.所得超支化聚合物經(jīng)核磁共振氫譜及紅外光譜表征[13].

圖1 超支化聚酰胺胺的合成Fig.1 The synthesis of hyperbranched PAMAM

1.3 細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)

選用Hela細(xì)胞，接種到24孔板中，細(xì)胞密度為25 000 個(gè)/孔，在DMEN培養(yǎng)基中37 ℃培養(yǎng)24 h.以培養(yǎng)基為溶劑，在24孔板中引入超支化聚酰胺胺化合物，最高質(zhì)量濃度為80 mg/mL，最低質(zhì)量濃度為0.002 44 mg/mL，并作空白對照.24 h后于24孔板中加入MTT試劑(終質(zhì)量濃度為0.05 mg/mL)，反應(yīng)4 h后，移除多余溶液，加入DMSO，染色后細(xì)胞呈紫色，利用酶標(biāo)儀測量吸光度，在590 nm處測得細(xì)胞溶液的吸收值，并計(jì)算細(xì)胞成活率.

1.4 抑菌實(shí)驗(yàn)

1.4.1 超支化聚酰胺胺對大腸桿菌的抑菌實(shí)驗(yàn) 選用大腸桿菌接種到96孔板LB培養(yǎng)液中生長，同時(shí)引入超支化聚酰胺胺化合物，最高質(zhì)量濃度為25 mg/mL，最低質(zhì)量濃度為0.012 2 mg/mL，并作空白對照.將含有超支化聚酰胺胺的大腸桿菌培養(yǎng)液及空白對照置于搖床培養(yǎng)，每隔半小時(shí)對菌種生長情況進(jìn)行測量，并記錄結(jié)果.

1.4.2 超支化聚酰胺胺對金黃葡萄球菌的抑菌實(shí)驗(yàn) 選用金黃葡萄球菌接種到96孔板LB培養(yǎng)液中生長，同時(shí)引入超支化聚酰胺胺化合物，最高質(zhì)量濃度為25 mg/mL，最低質(zhì)量濃度為0.012 2 mg/mL，并作空白對照.將含有超支化聚酰胺胺的大腸桿菌培養(yǎng)液及空白對照置于搖床培養(yǎng)，每隔半小時(shí)對菌種生長情況進(jìn)行測量，并記錄結(jié)果.

2 結(jié)果與討論

2.1 超支化聚酰胺胺的細(xì)胞毒性

圖2是超支化聚酰胺胺化合物對Hela細(xì)胞的毒性測試結(jié)果：

圖2 超支化聚酰胺胺對Hela細(xì)胞的毒性測試 Fig.2 The test of cytotoxicity of hyperbranched PAMAM with Hela cells 注：lnC為化合物質(zhì)量濃度的對數(shù)值，C的單位為mg/mL.

細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明，在較低濃度時(shí)(lnC值在-4.5～-6之間)，超支化聚酰胺胺對Hela細(xì)胞的毒性較小，細(xì)胞成活率在80%以上，隨濃度升高，化合物溶液的細(xì)胞毒性逐漸增大，但直到質(zhì)量濃度為20 mg/mL時(shí)(lnC≈3)，細(xì)胞成活率仍保持在50%以上.繼續(xù)增加濃度導(dǎo)致超支化聚酰胺胺的細(xì)胞毒性上升，質(zhì)量濃度為80 mg/mL時(shí)，細(xì)胞成活率在30%左右.

超支化聚酰胺胺的細(xì)胞毒性來自于其表面大量的伯胺基團(tuán).細(xì)胞由細(xì)胞壁，細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核組成，其中細(xì)胞壁含有大量的磷脂.超支化聚酰胺胺表面的伯胺基帶正電荷，易與帶負(fù)電荷的磷脂結(jié)合破壞細(xì)胞壁，從而導(dǎo)致細(xì)胞壁的破裂，使?fàn)I養(yǎng)物質(zhì)流出，細(xì)胞因此凋亡.

2.2 超支化聚酰胺胺的抗菌性能

2.2.1 對大腸桿菌(革蘭氏陽性菌)的抑制結(jié)果 選取質(zhì)量濃度為25、12.5、3.125 mg/mL和1.563 mg/mL超支化聚酰胺胺化合物的抑菌曲線作圖，如圖3所示.橫坐標(biāo)為細(xì)菌生長時(shí)間，縱坐標(biāo)為細(xì)菌溶液吸光度，用以說明細(xì)菌的繁殖程度.空白對照，即不含超支化聚酰胺胺化合物的大腸桿菌生長情況.

圖3 超支化聚酰胺胺對大腸桿菌的抗菌性能Fig.3 The antimicrobial activity of hyperbranched PAMAM with Escherichia coli

從圖3中可知，在沒有超支化聚酰胺胺存在時(shí)，大腸桿菌隨時(shí)間增加繁殖程度變化明顯，在約3 h之內(nèi)繁殖較快，之后則速度放緩，但仍保持一定的生長趨勢.在超支化聚合物濃度較低時(shí)(如1.563 mg/mL和3.125 mg/mL)，大腸桿菌在初期的生長速度雖略有下降，但仍然很快；而在3 h之后，溶液的吸光值基本保持不變，表明大腸桿菌的繁殖與消亡達(dá)到平衡.由此可知超支化聚酰胺胺在低濃度時(shí)即有一定的抗菌性能.在濃度較高時(shí)(如12.5 mg/mL和25 mg/mL)，超支化聚酰胺胺則可以完全抑制大腸桿菌的生長.其抑菌效果略低于文獻(xiàn)報(bào)道[14].

2.2.2 對金黃葡萄球菌(革蘭氏陽性菌)的抑制結(jié)果 選取質(zhì)量濃度為25、3.125、0.4 mg/mL和0.05 mg/mL超支化聚酰胺胺化合物的抑菌曲線作圖，如圖4所示.橫坐標(biāo)為細(xì)菌生長時(shí)間，縱坐標(biāo)為細(xì)菌溶液吸光度，用以說明細(xì)菌的繁殖程度.空白對照，即不含超支化聚酰胺胺化合物的金黃葡萄球菌生長情況.

圖4 超支化聚酰胺胺對金黃葡萄球菌的抗菌性能Fig.4 The antimicrobial activity of hyperbranched PAMAM with Staphylococcus aureus

從圖4中可知，在沒有超支化聚酰胺胺存在時(shí)，金黃葡萄球菌隨時(shí)間增加繁殖程度變化明顯，在測試時(shí)間范圍內(nèi)基本保持一定的生長速度.在所測試的較大濃度范圍內(nèi)(0.05～25 mg/mL)，超支化聚酰胺胺都可以顯示出良好的抗菌性能，完全抑制金黃葡萄球菌的生長.該化合物抑菌效果優(yōu)于文獻(xiàn)報(bào)道[14].

從抑菌曲線可知超支化聚酰胺胺對大腸桿菌，金黃葡萄球菌的生長都有一定的抑制作用，但抑制效果有所不同.其中超支化化合物對革蘭氏陽性菌金黃葡萄球菌的抗菌效果要明顯好于革蘭氏陰性菌大腸桿菌.這與兩種細(xì)菌的不同結(jié)構(gòu)有關(guān).革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌的差別主要來自于它們的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)不同.革蘭氏陽性菌的細(xì)胞壁壁厚約為20～80 nm，主要成分是肽聚糖和磷壁酸，二者含量占整個(gè)細(xì)胞壁質(zhì)量的90%.革蘭氏陰性菌的細(xì)胞壁較薄，磷壁酸只占大約5%，但是其細(xì)胞壁組分比較復(fù)雜，有一層陽性菌所不具備的外膜結(jié)構(gòu)，對于外源分子形成了一層附加的屏障，從而阻止其與細(xì)菌進(jìn)行作用.超支化聚酰胺胺末端帶有大量帶正電荷的伯胺基團(tuán)，屬于陽離子抗菌劑.一般而言，陽離子抗菌劑通過破壞肽聚糖結(jié)構(gòu)從而達(dá)到殺菌的目的.因此，超支化聚酰胺胺化合物對大腸桿菌的抑制效果不如金黃葡萄球菌.

通過合成得到的超支化聚酰胺胺對革蘭氏陽性菌金黃葡萄球菌及革蘭氏陰性菌大腸桿菌均有一定的抑制效果，特別是對于金黃葡萄球菌有較佳的抗菌性能，可以以此為基礎(chǔ)開發(fā)具有超支化結(jié)構(gòu)的水處理抗菌劑.

3 結(jié) 語

a. 以丙烯酸甲酯和乙二胺為原料，通過逐步升溫法制備了超支化聚酰胺胺化合物，其末端帶有大量伯胺基團(tuán).

b. 對合成的超支化聚酰胺胺進(jìn)行了細(xì)胞毒性測試，結(jié)果表明其細(xì)胞毒性隨質(zhì)量濃度增加而增大，在20 mg/mL以下時(shí)細(xì)胞毒性較小，細(xì)胞存活率在50%以上.

c. 以革蘭氏陽性菌金黃葡萄球菌及革蘭氏陰性菌大腸桿菌為實(shí)驗(yàn)對象測試了超支化聚酰胺胺的抗菌性能，結(jié)果表明超支化聚酰胺胺對大腸桿菌和金黃葡萄球菌均有一定的抑制效果，在12.5 mg/mL時(shí)可以完全抑制大腸桿菌的生長，而在0.05 mg/mL濃度下即可完全抑制金黃葡萄球菌的生長.超支化聚酰胺胺化合物在水處理抗菌劑方面具有廣闊的應(yīng)用前景.

致 謝

本研究得到國家自然科學(xué)基金委員會的資助，特表感謝！

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