劉 亮，鄭曉梅，楊福兵，王 斌，包長順，陳禮剛

ADAMDEC1具有金屬內(nèi)肽酶、整聯(lián)蛋白結(jié)合的活性，參與蛋白水解，負調(diào)控細胞附著，破壞腫瘤細胞侵襲的組織學屏障，在腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移中起關鍵作用[1-2]。已有研究顯示，ADAMDEC1在顱咽管瘤組織中可過度表達，并在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展過程中發(fā)揮著重要而復雜的作用。因此，從腫瘤細胞表達ADAMDEC1基因的角度來研究人顱咽管瘤細胞生長增殖的機制，對認識腫瘤發(fā)生、發(fā)展的機制以及基因治療等具有十分重要的意義。

1 材料與方法

1.1 材料 顱咽管瘤細胞，由我室自行經(jīng)原代培養(yǎng)獲得[3]。Trizol提取液購自美國Rothe公司，Western bloting試劑購自Amersco公司，RT-PCR試劑盒購自大連寶生物技術發(fā)展中心，DNA Marker DL2000購自寶生物工程有限(大連)公司，即用型SABC試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司，DAB顯色試劑盒購自美國DAKO公司，鼠抗人ADAMDEC1單克隆抗體購自美國Santa公司，DNA Marker購自北京新長江生物科技有限公司，重組人生長激素(rhGH)購自長春金賽藥業(yè)有限責任公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 將處于對數(shù)生長期的顱咽管瘤細胞3×103/ml培養(yǎng)24 h，實驗組分別加入濃度為10 ng/ml、100 ng/ml、1 000 ng/ml的rhGH，對照組加入不含rhGH的等體積的培養(yǎng)液，再繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，進行后續(xù)實驗。

1.2.2 RT-PCR檢測顱咽管瘤細胞ADAMDEC1 mRNA的表達 用RNAiso Plus試劑盒提取實驗組與對照組顱咽管瘤細胞的總RNA，操作按試劑盒說明書進行。瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA完整性，紫外分光光度計測定濃度和純度，計算樣品的總RNA濃度。利用Primer 5自行設計引物，交由上海英俊公司合成，采用人穩(wěn)定表達的基因β-actin作參照，序列如下，ADAMDEC1上游引物：5′-CATCTTCGGTTGCTGTTATT-3′，下游引物：5′-CACTCTGTGGTATGGTTTGG-3′；擴增產(chǎn)物長度：424 bp，退火溫度：58.2 ℃。β-actin上游引物：5′-GGCATCCACGAAACTACCTT-3′，下游引物：5′-TCCTGCTTGCTGATCCACAT-3′，擴增產(chǎn)物長度：266 bp，退火溫度：56 ℃。按照Revert Aid TM First Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒說明書進行RT-PCR。反應體系擴增條件：94 ℃預變性5 min，94 ℃變性1 min，58.2 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，共33個循環(huán)，最后72 ℃總延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，由Bio-Rad凝膠成像儀拍攝PCR產(chǎn)物凝膠圖像，并用Quantity One軟件進行相對定量分析。以目的條帶和內(nèi)參β-actin的灰度比值來判斷ADAMDEC1 mRNA表達的高低。

1.2.3 Western bloting檢測ADAMDEC1蛋白在顱咽管瘤細胞中的表達 將實驗組與對照組顱咽管瘤細胞用PBS洗滌3次，再根據(jù)蛋白提取試劑盒說明提取蛋白。采用Bradford方法檢測蛋白濃度。等量的蛋白(25 μg)進行聚丙烯酰胺凝膠(8%)電泳，采用半干法將凝膠內(nèi)的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)至PVDF膜上，用含5%脫脂牛奶的TBST溶液室溫封閉1.5 h，再分別與鼠抗人ADAMDEC1單克隆抗體(1∶300)和鼠抗人β-actin(1∶1 000)4 ℃孵育過夜，與二抗生物素化兔抗鼠IgG(1∶1 000)室溫孵育1 h，與ECL試劑反應。采用Bio-Rad凝膠成像儀拍攝凝膠圖像，并用Quantity One軟件分析灰度值，以目的蛋白與其對應的β-actin灰度值之比來比較目的蛋白表達量。以上實驗重復3次。

2 結(jié)果

2.1 rhGH對顱咽管瘤細胞ADAMDEC1 mRNA表達的影響 隨著rhGH濃度的增加，ADAMDEC1 mRNA的表達增加，rhHG 1 000 ng/ml組的表達最高(見圖1)。并測出顱咽管瘤細胞ADAMDEC1 mRNA目的基因/內(nèi)參照的吸光度比值，且rhHG 1 000 ng/ml組的比值最高(見表1)。

2.2 rhGH對顱咽管瘤細胞ADAMDEC1蛋白表達的影響 隨著rhGH濃度的增加，ADAMDEC1蛋白的表達增加，rhHG 1 000 ng/ml組的表達最高(見圖2)。Western bloting檢測各組積分光密度(IOD)值比較(去除β-actin)，rhHG 1 000 ng/ml組的比值最高(見圖3)。

注：M為Marker，1為rhGH 1 000 ng/ml組，2為rhGH 100 ng/ml組，3為rhGH 10 ng/ml組，4為對照組

圖1 RT-PCR檢測各組ADAMDEC1 mRNA的表達

Figure1 Expression of ADAMDEC1 mRNA in the groups by RT-PCR

注：C：對照組；GL：rhGH 10 ng/ml組；GM：rhGH 100 ng/ml組；GH：rhGH 1 000 ng/ml組

圖2 Western bloting檢測各組ADAMDEC1蛋白的表達

Figure2 Expression of ADAMDEC1 protein in the groups by Western bloting

注：C：對照組；GL：rhGH 10 ng/ml組；GM：rhGH 100 ng/ml組；GH：rhGH 1 000 ng/ml組

圖3 各組相對灰度值的比較

Figure3 Comparison of the relative value of each gray

表1 顱咽管瘤細胞ADAMDEC1 mRNA目的基因/內(nèi)參照的吸光度比值

注：與對照組比較，*P<0.05；與rhGH 10 ng/ml組比較，△P<0.05；與rhGH 100 ng/ml組比較，▲P=0.023

3 討論

ADAMDEC1是一種分泌蛋白，屬于解聚素金屬蛋白酶家族。只有部分解聚素域，完全缺乏富含半胱氨酸域。因此，其屬于一種新的ADAM亞科。ADAMDEC1在樹突狀細胞成熟期間表達上調(diào)，表明這種蛋白質(zhì)可能會扮演一個樹突狀細胞的功能和生發(fā)中心T細胞相互作用的重要作用。研究發(fā)現(xiàn)人與小鼠ADAMDEC1基因都位于8p12 染色體上，且ADAMDEC1、ADAM7和ADAM28組成金屬蛋白酶基因群。它們的親緣關系提示這些蛋白酶擁有相似的功能[4]。Hwang等[2]采用半定量RT-PCR方法檢測了人肝細胞瘤細胞系，發(fā)現(xiàn)ADAMDEC1過度表達，從而推測其在腫瘤細胞的遷移過程中發(fā)揮重要作用。Crouser等[1]采用免疫組織化學方法發(fā)現(xiàn)，肺肉樣瘤病組織中，基質(zhì)金屬蛋白酶12和ADAMDEC1高度表達，超過正常組織的25倍，并與疾病的嚴重程度相關聯(lián)。從而認為基質(zhì)金屬蛋白酶12和ADAMDEC1基因可能參與了肺部的損害或改造，并可作為疾病活動的指標。

顱咽管瘤是常見的顱內(nèi)良性腫瘤，因其占位效應或侵襲性，干擾垂體和下丘腦功能，導致多種激素分泌不足[5]。無論手術全切或者放、化療都會加重激素紊亂程度，經(jīng)治療干預后，生長激素分泌不足發(fā)生率可高達95%，其中70%的患者需不同程度生長激素替代治療[6]。顱咽管瘤患者絕大多數(shù)為促生長激素釋放激素(下丘腦分泌)-生長激素(垂體前葉分泌)軸損傷，rhGH是主要替代藥物[7]。生長激素分子與其受體結(jié)合而發(fā)揮生物學效應[8-9]，這種效應主要由兩種相關多肽胰島素樣生長因子(IGF-Ⅰ)、IGF-Ⅱ介導[10]，通過抑制凋亡的發(fā)生，可促進細胞黏附、刺激血管的形成以及對細胞外基質(zhì)的重塑等諸多途徑對腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移有顯著的刺激作用，對已存在的腫瘤有明顯的促生長作用。Gaillard等[11]調(diào)查顯示，在所有生長激素替代治療的患者中，以顱咽管瘤患者的病死率最高，這可能與腫瘤復發(fā)率較高相關。本實驗證實，在培養(yǎng)的顱咽管瘤細胞中，與對照組相比，加入rhGH的實驗組中，其顱咽管瘤細胞表達ADAMDEC1的量均增多。且隨著加入rhGH濃度的增加，ADAMDEC1 mRNA的表達和ADAMDEC1蛋白的表達均增加，并在rhHG 1 000 ng/ml時達到最高。故在體外實驗中，rhGH可以使顱咽管瘤細胞表達ADAMDEC1量增多，并促進了腫瘤細胞的增殖。因此，對于生長激素水平低下的顱咽管瘤患者，在使用rhGH替代治療時，應慎重考慮其促進腫瘤細胞生長增殖以及復發(fā)的可能性。

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4 Mochizuki S，Shimoda M，Shiomi T，et al.ADAM28 is activated by MMP-7(matrilysin-1)and cleaves insulin-like growth factor binding protein-3[J].Biochem Biophys Res Commun，2004，315(1)：79-84.

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