婁 濤，李文強，顧家鵬，李時光，顧仁駿，張 萍，王夏紅，張紅星，

李 巍，張紅亞，趙建民，潘 登，李 靜，靳 玫，吳 強

急性一氧化碳中毒(acute carbon monoxide poisoning,ACMP)是較常見的職業(yè)性及生活性中毒，可造成以中樞神經系統(tǒng)及心血管系統(tǒng)功能損害為主的全身各組織細胞的損傷[1]。部分ACMP患者經治療意識清醒后,經過3～60 d〔平均(23.8±14.0)d〕表現(xiàn)正?；蚪咏５拈g歇期，會出現(xiàn)急性一氧化碳中毒后遲發(fā)性腦病(delayed encephalopathy after acute carbon monoxide poisoning,DEACMP)，該病是以癡呆、精神失常和錐體外系癥狀為主要表現(xiàn)的一組神經精神癥狀。DEACMP的影像及病理改變主要為雙側蒼白球對稱性軟化灶和大腦白質廣泛的脫髓鞘，海馬區(qū)亦有不可逆損害等[2-3]。目前認為急性中毒后缺氧損傷導致血-腦脊液屏障開放產生的自身免疫反應是其重要的病理機制[4-5]，但年齡、性別類似且中毒程度相同的患者發(fā)生概率又有很大的差別，提示存在個體間的差異，推測個體遺傳因素可能起到了重要的作用。DEACMP的早期病理改變—腦白質廣泛的脫髓鞘及晚期病理改變—腦萎縮等特點均與多發(fā)性硬化(multiple sclerosis,MS)類似，兩者同屬于獲得性中樞神經系統(tǒng)脫髓鞘疾病，在腦部病理損傷中有著許多共同之處。關于DEACMP的基因研究目前相關報道較少。本實驗選取MS易患基因酪氨酸激酶2(tyrosine kinase 2,TYK2)[6-7]的rs10876994和rs34536443位點，研究TYK2基因多態(tài)性與DEACMP的遺傳易患性之間的關系。

1 對象與方法

1.1 研究對象 收集2006年10月—2010年10月在新鄉(xiāng)醫(yī)學院第二附屬醫(yī)院、新鄉(xiāng)市中心醫(yī)院等11家醫(yī)院急診科和神經內科住院的ACMP昏迷患者224例，鑒于30歲以下DEACMP患者極為罕見，為了達到相對匹配，研究對象入組年齡定為40歲以上。DEACMP符合內科學第六版診斷標準[1]，ACMP符合國家職業(yè)性ACMP診斷標準GB8781-88。均排除以下情況：過敏史；近2周內發(fā)生感染；接受過免疫抑制劑治療及激素治療；近半年內接受過預防接種；嚴重的心、肝、腎疾病；中樞神經系統(tǒng)疾病；嚴重的糖尿病、內分泌疾病、免疫系統(tǒng)疾病、惡性腫瘤、營養(yǎng)不良、酒精依賴及其他精神疾??；妊娠、哺乳及月經期婦女。由于DEACMP的假愈期最長為60 d，因此對ACMP患者均隨訪90 d以上，根據(jù)是否出現(xiàn)DEACMP分為兩組。DEACMP組共109例，其中男55例，女54例；年齡42～89歲，平均(59.7±9.7)歲。ACMP時均有昏迷史，昏迷持續(xù)時間(發(fā)現(xiàn)昏迷到意識清醒的時間)2～72 h，平均(16.1±15.1)h。間歇期(ACMP昏迷清醒后到出現(xiàn)遲發(fā)性腦病癥狀的時間)7～45 d，平均(20.3±9.4)d。ACMP組共115例，其中男50例，女65例；年齡40～84歲，平均(56.1±7.4)歲。ACMP時均有昏迷史，昏迷持續(xù)時間1～51 h，平均(6.8±7.5)h。兩組均為豫北地區(qū)漢族患者，兩組間性別、年齡具有均衡性。經新鄉(xiāng)醫(yī)學院第二附屬醫(yī)院倫理委員會批準，所有入組對象或其法定監(jiān)護人均簽署知情同意書。

1.2 研究方法

1.2.1 DNA提取 所有受試者采集外周靜脈血，乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝低溫凍存待用。采用天根生化科技RelaxGene血液基因組DNA提取試劑盒提取DNA。

1.2.2 rs10876994和rs34536443位點基因分型 rs10876994、rs34536443位點引物序列設計和TaqMan MGB熒光探針序列設計均由美國應用生物系統(tǒng)公司(AB公司)完成。聚合酶鏈反應(PCR)的擴增反應在ABI 7900 PCR儀中進行，擴增程序為：(1)AmpliTaq Gold Enzyme活化95 ℃ 10 min；(2)PCR(60個循環(huán))：變性92 ℃ 15 s，退火60 ℃ 60 s，延伸60 ℃ 60 s。反應完成后直接由ABI 7900掃描讀取數(shù)據(jù)，產生結果并保存。對基因分型進行質量控制，隨機抽取20例樣本委托上海歐易生物醫(yī)學科技有限公司采用ABI 3730基因測序儀對2個位點所在區(qū)域進行DNA直接測序，分析其基因型。

1.2.3 神經心理學評估 患者入院后每3 d評估一次長谷川癡呆量表(HDS)、常識-記憶-注意測驗(IMCT)、日常生活能力量表(ADL)，直至治療顯效時為止[8]，3種智力量表取最差值。

2 結果

2.1 基因分型質量控制 熒光定量PCR基因型檢測結果與測序結果符合率為99.25%。樣本尺寸224能提供0.81的統(tǒng)計學效力，發(fā)現(xiàn)對基因型分布的微效影響(r=0.10～0.23)。rs34536443位點在研究群體內無多態(tài)性，在后續(xù)分析里剔除。

2.2 Hardy-Weinberg平衡分析結果 rs10876994位點基因型分布在全部樣本中符合Hardy-Weinberg平衡(χ2=2.43,P=0.12)。

2.4 神經心理學分析 不同基因型患者ADL和IMCT評分比較，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；不同基因型患者HDS評分比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05，見表3)。

表2 兩組不同性別rs10876994位點基因型分布和等位基因頻率比較〔n(%)〕

表1 兩組rs10876994位點基因型分布和等位基因頻率比較〔n(%)〕

表3 rs10876994位點不同基因型患者神經心理學的比較分)

注：HDS=長谷川癡呆量表，IMCT=常識-記憶-注意測驗，ADL=日常生活能力量表；與AA攜帶者比較，*P<0.05；與AC攜帶者比較，△P<0.05

3 討論

中樞神經系統(tǒng)脫髓鞘疾病是以腦和脊髓髓鞘破壞或脫失病變?yōu)橹饕卣鞯募膊。ㄟz傳性和獲得性兩大類。獲得性中樞神經系統(tǒng)脫髓鞘疾病可分為繼發(fā)于其他疾病的脫髓鞘病和原發(fā)性免疫介導的炎性脫髓鞘病。前者包括缺血缺氧性疾病(如DEACMP)、營養(yǎng)缺乏性疾病(亞急性聯(lián)合變性)等，后者包括MS、視神經脊髓炎等。此類疾病發(fā)病多集中在自身免疫損傷和髓鞘結構破壞兩大環(huán)節(jié)，且具有遺傳易患性[9]。DEACMP屬于典型的繼發(fā)性脫髓鞘病，病理改變和臨床表現(xiàn)與MS等疾病具有諸多相似性。目前認為DEACMP是由于缺血缺氧導致腦組織壞死和血-腦脊液屏障開放，激發(fā)嚴重免疫反應性髓鞘受損，導致在神經損傷和修復過程中出現(xiàn)的一系列神經和精神癥狀[2]。該病的發(fā)生與否及病情進展的程度與中毒程度、搶救措施、患者身體狀況均有關。本課題組前期對豫北地區(qū)10年內405例DEACMP患者的發(fā)病情況進行了調查，年齡和中毒程度基本相同的74對ACMP夫妻患者中同時患DEACMP者僅有10對，且與中毒的嚴重程度無關。說明除年齡、中毒程度外還有其他因素影響DEACMP的發(fā)生，提示DEACMP患者在對ACMP后的解毒、免疫損傷、細胞凋亡等方面可能存在個體差異，推測個體遺傳因素可能起到了重要的作用。

人TYK2基因是非受體型蛋白酪氨酸激酶，與Ⅰ型和Ⅱ型細胞因子受體結合，通過磷酸化受體的亞基放大信號，是免疫激活和抗病毒感染的重要角色[10]。白介素6、白介素12、一氧化氮合成酶(NOS)、干擾素等的激活均與其有關。有報道證實TYK2是MS的易患基因[5-7,11]，推測可能是該基因的變異改變了其表達產物的活性，對下游信號的傳遞和放大產生影響，與其他基因共同導致了疾病的發(fā)生。在對DEACMP患者外周血清的研究發(fā)現(xiàn)白介素6、白介素10和NOS均高于對照人群[3-4,12]，提示了DEACMP也可能有TYK2基因的參與。本研究比較了該基因的rs10876994和rs34536443位點在豫北漢族DEACMP組和ACMP組人群中的分布，發(fā)現(xiàn)兩組間無差異。按性別分層后，兩組間仍無差異。進一步的分析發(fā)現(xiàn)，rs10876994位點不同基因型攜帶者在病情最嚴重時的ADL和IMCT有差異，AA基因型攜帶者表現(xiàn)出了較輕的神經心理學缺陷，表現(xiàn)為保護因素。臨床癥狀關聯(lián)的研究結果在精神疾病研究中并不少見，林鄞等[13]最近就報道了G72 基因rs947267多態(tài)性與雙相情感障礙患者的認知功能存在關聯(lián)，但該位點與疾病的關聯(lián)分析只得到了陰性結果。這些易患基因可能通過影響神經系統(tǒng)發(fā)育、神經遞質傳遞功能等，在一定條件下引發(fā)神經發(fā)育障礙所致的認知和行為紊亂。臨床癥狀的關聯(lián)將有助于更細致地理解復雜性遺傳疾病微效基因的易患機制。

本研究結果雖未證實TYK2基因與EDACMP的遺傳關聯(lián)，但神經心理學功能與本研究多態(tài)性位點的關聯(lián)提示TYK2基因可能參與了該病的發(fā)生發(fā)展。未來應在動物實驗中對TYK2基因在ACMP及DEACMP發(fā)生過程中的基因表達變化進行研究，在遺傳水平上也應加大樣本量，增加臨床表型的采集和分析，最終闡明TYK2基因與DEACMP的關系。

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