許 倩，肖麗君，趙恩宏,魏憲嘉，張海燕,趙 爽，鄭 鑫

乳腺癌從早期即表現(xiàn)為全身性疾病，可發(fā)生血行播散，近年有關(guān)乳腺癌侵襲、轉(zhuǎn)移的靶向治療成為重要課題。熱休克蛋白90 (heat shock protein 90,HSP90)是一種重要的分子伴侶，可與乳腺癌細(xì)胞中的一些信號分子和激酶結(jié)合形成復(fù)合物，從而參與調(diào)控乳腺癌的侵襲轉(zhuǎn)移能力[1]。乳腺癌細(xì)胞對藥物破壞HSP90功能顯示高度的敏感性，HSP90成為乳腺癌細(xì)胞內(nèi)藥物作用的理想靶點(diǎn)。17-烯丙氨基格爾德霉素(17-allylamino-17-demethoxy geldanamycin，17-AAG)作為一種新的HSP90抑制劑，因其獨(dú)特的作用靶點(diǎn)和高效的抗腫瘤活性及對機(jī)體的低毒性近年來備受關(guān)注。17-AAG抗乳腺癌作用顯著，目前已在進(jìn)行Ⅱ期臨床實(shí)驗(yàn)[2]。17-AAG有抗乳腺癌侵襲作用，但缺乏深入研究。本研究以高轉(zhuǎn)移乳腺癌細(xì)胞系MCF-7為研究對象，觀察了17-AAG對MCF-7細(xì)胞基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-2、MMP-9 mRNA和蛋白表達(dá)的影響，試圖探尋17-AAG對乳腺癌侵襲、轉(zhuǎn)移的干預(yù)作用，并明確17-AAG對MMP-2、MMP-9表達(dá)調(diào)控的抑制作用是其抗侵襲、轉(zhuǎn)移的重要機(jī)制之一。為17-AAG在乳腺癌治療中的開發(fā)和應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)和理論依據(jù)，為相關(guān)抗腫瘤藥物的開發(fā)提供新思路。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1細(xì)胞來源人乳腺癌MCF-7細(xì)胞系由承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室惠贈。

1.1.2試劑17-AAG(深圳生爾易美有限公司)；胎牛血清(杭州四季青生物制劑公司)；DMEM培養(yǎng)基、3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽(MTT)、瓊脂糖(美國Gibco公司)；Trizol總RNA提取試劑(美國Invitrogen 公司)；反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)試劑盒(大連寶生物公司)；引物及內(nèi)參(上海生工)；MMP-2、MMP-9、β-actin單克隆抗體(美國Santa Cruz公司)；辣根酶標(biāo)記羊抗兔和羊抗鼠IgG(美國KPL公司)；ECL超敏發(fā)光液(北京普利萊公司)；DNA Marker(大連寶生物公司)。

1.1.3儀器090-135.001倒置顯微鏡(德國Leica公司)；Sorvall/Biofuge fresco高速冷凍離心機(jī)(德國Heraeus公司)；150培養(yǎng)箱(德國Heraeus公司)；MK3酶標(biāo)儀(芬蘭雷勃公司)；Icycler PCR儀(美國Bio-Rad公司)；96、6孔細(xì)胞培養(yǎng)板(美國Corning公司)。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1四甲基偶氮唑鹽微量酶反應(yīng)比色法(MTT法)檢測17-AAG對MCF-7細(xì)胞增殖的影響

1.2.1.1MCF-7細(xì)胞的增殖培養(yǎng)取對數(shù)生長期的MCF-7細(xì)胞置于96孔板中培養(yǎng)，細(xì)胞初始濃度為5×104/ml，190 μl/孔，然后置37 ℃ 5%二氧化碳(CO2)培養(yǎng)箱培養(yǎng)至70%融合，加入不同終濃度的17-AAG，其濃度分別為10.000、5.000、2.500、1.250、0.625、0.310、0.165 mg/L；每1個(gè)濃度設(shè)4個(gè)平行孔，共溫育48 h。同時(shí)設(shè)立不加藥物的空白對照組，繼續(xù)培養(yǎng)24 h和48 h。

1.2.1.2MTT法檢測MCF-7細(xì)胞的增殖終止培養(yǎng)前4 h每孔加入5 g/L的MTT溶液，每孔10 μl，輕振幾下培養(yǎng)板，再放回培養(yǎng)箱，培養(yǎng)4 h，然后吸凈上清液。加入二甲基亞砜150 μl/孔，振蕩60 min，使紫藍(lán)色結(jié)晶完全溶解?；靹蚝?，在酶標(biāo)儀上檢測492 nm波長處的A值。計(jì)算17-AAG對腫瘤細(xì)胞的生長抑制率=(1-A對照組)/A實(shí)驗(yàn)組×100%。以同一樣品的不同濃度對腫瘤細(xì)胞的抑制率作圖得到劑量反應(yīng)曲線，計(jì)算半數(shù)抑制濃度(IC50)。

1.2.2RT-PCR法檢測17-AAG作用后MCF-7細(xì)胞MMP-2、MMP-9 mRNA的表達(dá)

1.2.2.1MCF-7 細(xì)胞總RNA的提取取對數(shù)生長期細(xì)胞，0.25%胰酶消化，制成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×104/ml，加入至6孔板，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中至70%融合后，加入17-AAG(終濃度：1.0、2.0、3.0、5.0 mg/L)，每個(gè)濃度設(shè)5個(gè)復(fù)孔，同時(shí)設(shè)立對照組(不加藥組)。終止培養(yǎng)后，按照試劑操作流程進(jìn)行RNA提取，1%瓊脂糖凝膠電泳顯示28 S和18 S 2條完整的條帶，28 S條帶亮度是18 S的2倍；紫外分光光度計(jì)測A值，A260/A280比值在1.8～2.0，說明RNA純度較高，而且比較完整。

1.2.2.2RT-PCR法檢測MMP-2、MMP-9 mRNA的表達(dá)按照RT-PCR試劑盒進(jìn)行具體操作。MMP-2基因上游引物：5′-GCTTGGCTTCAATCAAAGAGT-3′，下游引物：5′-TGCGAGGGAAGAAGTTGTAGTT-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物345 bp；MMP-9基因上游引物:5′-TCGTGCCTCTGCCCATAGG-3′，下游引物:5′-CACCCTTGTGCTCTTCCCTG-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物：462 bp；內(nèi)參照β-actin基因上游引物：5′-AGCGGGAAATCGTGCGTGAC-3′，下游引物：5′-ACATCTGCTGGAAGGTGGAC-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物:453 bp。cDNA的合成：30 ℃、10 min，42 ℃、30 min，99 ℃、5 min，5 ℃、5 min。PCR擴(kuò)增MMP-2：94 ℃、2 min，94 ℃、30 s，55 ℃、30 s，72 ℃、45 s，30個(gè)循環(huán)；PCR擴(kuò)增MMP-9：94 ℃、2 min，94 ℃、30 s，57 ℃、30 s，72 ℃、1 min，28個(gè)循環(huán)；PCR擴(kuò)增內(nèi)參照β-actin：94 ℃、2 min，94 ℃、30 s，58 ℃、30 s，72 ℃、1 min，28個(gè)循環(huán)。將產(chǎn)物于2%瓊脂糖凝膠電泳，恒壓120 V，30 min，UVP成像分析系統(tǒng)拍照觀察。圖片掃描圖像用Quantity One 軟件進(jìn)行灰度分析，計(jì)算目的基因條帶與內(nèi)參照β-actin的灰度比值。

1.2.3蛋白印跡(Western Blotting)法檢測17-AAG作用后乳腺癌MCF-7細(xì)胞MMP-2、MMP-9的表達(dá)

1.2.3.1總蛋白的提取體外培養(yǎng)細(xì)胞至對數(shù)生長期，貼壁細(xì)胞用0.25%胰酶消化后，制成單細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)，離心，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×104/ml，加入到6孔板，37 ℃ 5%CO2培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)至70%融合，之后分別加入17-AAG，使其終濃度為1.0、2.0、3.0、5.0 mg/L，每個(gè)濃度設(shè)5個(gè)復(fù)孔，同時(shí)設(shè)立對照組(不加藥組)。48 h后終止培養(yǎng)，溫和磷酸鹽緩沖液洗細(xì)胞2次，加入冰預(yù)冷的適量細(xì)胞裂解液，冰上裂解20 min，4 ℃，12 000 r/min，離心半徑8.5 cm，離心20 min，收集上清液，按照BCA蛋白定量試劑盒說明進(jìn)行定量。

1.2.3.2取50 μg蛋白與5×SDS加樣緩沖液混合，100 ℃變性5 min，SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，以含5%脫脂奶粉TBS-T溶液〔10 mmol/L Tris-鹽酸,100 mmol/L氯化鈉(NaCl)+0.1%吐溫20〕封閉，室溫下與兔抗人MMP-2、MMP-9單克隆抗體(1∶300稀釋)共同孵育，再與相應(yīng)的HR-PO抗Ig抗體耦聯(lián)物(1∶2 000稀釋)孵育，以上步驟間用TBS-T常溫下充分洗膜。ECL檢測試劑盒顯影，洗片。同樣方法，以β-actin(1∶100稀釋)雜交作為內(nèi)參照。膠片經(jīng)掃描儀掃描后獲得圖像，用Quantity One分析軟件測定條帶灰度值，計(jì)算MMP-2、MMP-9的相對含量，即MMP-2或MMP-9條帶灰度值/內(nèi)參照β-actin條帶灰度值。

2　結(jié)果

2.117-AAG對乳腺癌MCF-7細(xì)胞增殖的影響10.000、5.000、2.500、1.250、0.625、0.310、0.165 mg/L 17-AAG及空白對照組培養(yǎng)24 h和48 h時(shí)A值比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F值分別為39.41和61.56，P<0.05，見表1)。體外作用24 h后IC50均值為34.61，體外作用48 h的IC50均值為6.22。

2.2不同濃度17-AAG對MCF-7細(xì)胞MMP-2、MMP-9 mRNA表達(dá)的影響對照組及1.00 mg/L組、2.00 mg/L組、3.00 mg/L組、5.00 mg/L組MMP-2/β-actin和MMP-9/β-actin比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；其中各組間兩兩比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見表2、圖1)。

表1不同濃度17-AAG培養(yǎng)24 h和48 h對乳腺癌MCF-7細(xì)胞增殖的影響比較

Table1Comparison of inhibitory effects of different concentrations of 17-AAG to human mammary cancer MCF-7 cells

17-AAG濃度(mg/L)24h A值(x±s) 抑制率(%)48h A值(x±s) 抑制率(%)10.0000.46±0.0237.690.40±0.0865.60 5.000 0.56±0.0324.150.50±0.0657.40 2.500 0.59±0.0121.150.53±0.0457.20 1.250 0.60±0.0417.850.55±0.0656.80 0.625 0.61±0.0216.010.59±0.0656.67 0.310 0.64±0.0112.680.63±0.0553.78 0.165 0.68±0.036.710.65±0.0553.03空白對照組0.73±0.03-1.17±0.08-

圖1不同濃度17-AAG對MCF-7細(xì)胞MMP-2、MMP-9 mRNA表達(dá)的影響

Figure1Effects of 17-AAG on the mRNA expression of MMP-2 and MMP-9 in MCF-7 cells with different concentrations

2.3不同濃度17-AAG對MCF-7細(xì)胞MMP-2、MMP-9表達(dá)的影響對照組及1.00 mg/L組、2.00 mg/L組、3.00 mg/L組、5.00 mg/L組MMP-2/β-actin和MMP-9/β-actin表達(dá)量比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；其中各組間兩兩比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見表3、圖2)。

Table2Effects of 17-AAG on the mRNA expression of MMP-2 and MMP-9 in MCF-7 cells with different concentrations

組別例數(shù)MMP-2/β-actin MMP-9/β-actin 對照組50.90±0.05 0.98±0.03 1.0mg/L組50.74±0.06△ 0.80±0.04△ 2.0mg/L組50.49±0.03△▲ 0.56±0.04△▲ 3.0mg/L組50.35±0.03△▲☆ 0.37±0.03△▲☆ 5.0mg/L組50.17±0.04△▲☆■0.26±0.03△▲☆■F值228.47368.59P值<0.05<0.05

注：與對照組比較，△P<0.05；與1.0 mg/L組比較，▲P<0.05；與2.0 mg/L組比較，☆P<0.05；與3.0 mg/L組比較，■P<0.05

Table3Effects of 17-AAG on the proteins expression of MMP-2 and MMP-9 in MCF-7 cells with different concentrations

組別例數(shù)MMP-2/β-actinMMP-9/β-actin對照組51.01±0.06 1.00±0.09 1.0mg/L組50.86±0.07△ 0.84±0.03△ 2.0mg/L組50.63±0.05△▲ 0.57±0.03△▲ 3.0mg/L組50.54±0.06△▲☆ 0.46±0.03△▲☆ 5.0mg/L組50.41±0.04△▲☆■0.30±0.05△▲☆■F值96.47145.15P值<0.05<0.05

注：與對照組比較，△P<0.05；與1.0 mg/L組比較，▲P<0.05；與2.0 mg/L組比較，☆P<0.05；與3.0 mg/L組比較，■P<0.05

圖2不同濃度17-AAG對MCF-7細(xì)胞MMP-2、MMP-9表達(dá)的影響

Figure2Effects of 17-AAG on the proteins expression of MMP-2 and MMP-9 in MCF-7 cells with different concentrations

3　討論

乳腺癌發(fā)病率和病死率逐年增加，嚴(yán)重威脅著女性健康。25%～30%的早期乳腺癌患者隨訪10～15年后發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，侵襲和轉(zhuǎn)移是乳腺癌患者死亡的主要原因?？鼓[瘤藥物對腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的抑制作用成為了一個(gè)重要的研究課題。HSP90是一種重要的分子伴侶，研究表明其可與乳腺癌細(xì)胞中的多種信號分子和激酶結(jié)合形成復(fù)合物，從而參與調(diào)控乳腺癌的侵襲轉(zhuǎn)移能力。17-AAG可對HSP90產(chǎn)生強(qiáng)烈的抑制作用，從而通過降解客戶蛋白、誘導(dǎo)腫瘤凋亡、干擾細(xì)胞周期等作用抑制腫瘤細(xì)胞的生長，近年來備受關(guān)注。國內(nèi)外目前針對17-AAG抗乳腺癌機(jī)制的研究主要集中在誘導(dǎo)腫瘤凋亡、干擾細(xì)胞周期等方面。由于17-AAG多靶點(diǎn)抗肺瘤作用的特點(diǎn)，新的生物學(xué)作用不斷被發(fā)現(xiàn)，很多確切機(jī)制還有待闡明，如抗侵襲作用雖有報(bào)道但缺乏深入研究。

腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移過程中首先必須具備降解細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)及基底膜(BM)的功能，進(jìn)而形成局部溶解區(qū)以構(gòu)成腫瘤細(xì)胞移動的通道，而這個(gè)降解功能主要由蛋白水解酶完成。MMP是重要的一類蛋白水解酶。近年來研究發(fā)現(xiàn)，MMPs通過對ECM、BM的降解作用和增強(qiáng)腫瘤性血管的生成作用而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移[3]。MMPs在人類腫瘤中廣泛而大量表達(dá)，大量研究證實(shí)MMPs的高水平表達(dá)與腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移能力以及預(yù)后不良有關(guān)，并在腫瘤的血管生成中起著決定性作用[4-5]。MMPs活性增加會加速細(xì)胞外基質(zhì)的降解作用，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的浸潤和轉(zhuǎn)移[6-7]。其中最重要的是MMP-2、MMP-9。正常情況下MMP-9的表達(dá)很低，其表達(dá)主要受位于20號染色體的基因轉(zhuǎn)錄控制。大量研究表明，許多惡性腫瘤組織及轉(zhuǎn)移灶中 MMP-9表達(dá)明顯增強(qiáng)，實(shí)驗(yàn)中抑制MMP-2活性可使腫瘤體積減少70%，將腫瘤細(xì)胞移植入MMP-2或MMP-9基因缺失的大鼠體內(nèi)，與正常對照組大鼠比較，腫瘤血管生成明顯減少[8]。

抗腫瘤藥物針對MMP-2和MMP-9的負(fù)性調(diào)控作用而發(fā)揮抗侵襲和轉(zhuǎn)移作用成為了一個(gè)重要的研究課題[9-10]。本研究結(jié)果顯示，17-AAG對人乳腺癌MCF-7細(xì)胞的增殖具有明顯的抑制作用，并能抑制MMP-2和MMP-9的表達(dá)。1.0、2.0、3.0、5.0 mg/L的17-AAG作用48 h后，對MCF-7細(xì)胞MMP-2和MMP-9 mRNA及其表達(dá)均下調(diào)，且具有濃度依賴性。說明17-AAG抑制MMP-2和MMP-9表達(dá)水平是其發(fā)揮抗腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移作用的重要機(jī)制之一。我們進(jìn)一步的工作將探尋17-AAG是通過什么通路對MMP-2和MMP-9進(jìn)行調(diào)控，這個(gè)過程是否還有其他因子參與。將進(jìn)一步豐富17-AAG抗乳腺癌侵襲的作用機(jī)制和作用靶點(diǎn)，為17-AAG在臨床上的進(jìn)一步開發(fā)和應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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