徐海燕 喬潔 韓兵 陳凱 夏蘇嬌 劉炳麗 郭郁郁 陸穎理 吳萬(wàn)齡

新的MEN1基因剪切突變導(dǎo)致多發(fā)性?xún)?nèi)分泌腺瘤病I型的家系研究

徐海燕 喬潔 韓兵 陳凱 夏蘇嬌 劉炳麗 郭郁郁 陸穎理 吳萬(wàn)齡

目的 對(duì)1例多發(fā)性?xún)?nèi)分泌腺瘤病I型（MEN1）患者進(jìn)行基因診斷和家系成員的隨訪。方法收集MEN1患者的臨床及家系資料，抽取先證者及5位家系成員外周血提取DNA，對(duì)MEN1基因的10個(gè)外顯子進(jìn)行PCR擴(kuò)增，用全自動(dòng)測(cè)序儀進(jìn)行測(cè)序分析。結(jié)果（1）經(jīng)MEN1基因突變檢測(cè)證實(shí),先證者存在內(nèi)含子5剪切位點(diǎn)的突變（IVS7+2 T→G）。（2）先證者無(wú)臨床表現(xiàn)的兒子也攜帶此突變，在基因診斷7個(gè)月后出現(xiàn)了明顯的臨床表現(xiàn)，術(shù)后病理證實(shí)為胰島β細(xì)胞瘤和左腎上腺腺瘤。結(jié)論臨床醫(yī)師應(yīng)常規(guī)對(duì)所有MEN1患者及其家系高危成員盡早進(jìn)行基因突變分析和篩查，并嚴(yán)格隨訪，從而改善疾病的預(yù)后。

多發(fā)性?xún)?nèi)分泌腺瘤病1型 MEN1基因 突變

多發(fā)性?xún)?nèi)分泌腺瘤病I型（MEN1）為一種常染色體顯性遺傳性疾病，發(fā)病率約為1/3萬(wàn)～1/5萬(wàn)?；颊咧饕憩F(xiàn)為甲狀旁腺腺瘤、胰島細(xì)胞瘤和垂體前葉腫瘤，還可能存在脂肪瘤、胸腺類(lèi)癌、嗜鉻細(xì)胞瘤、腎上腺瘤等其他少見(jiàn)類(lèi)型的腫瘤[1-2]。MEN1預(yù)后和早期診斷、治療密切相關(guān)，而分子生物學(xué)技術(shù)為臨床診斷開(kāi)辟了新的途徑，使該病早期診斷成為可能，大大提高了疾病的預(yù)后。本研究對(duì)麗水市中心醫(yī)院收治的1例MEN1的患者及家系成員進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)了一種新的剪切位點(diǎn)突變，并對(duì)其家系成員進(jìn)行了隨訪觀察。

1 對(duì)象和方法

1.1 對(duì)象 先證者，男，56歲。因“反復(fù)四肢乏力3年，加重10d”入院。患者于3年前出現(xiàn)四肢乏力，逐漸加重，起病第2天即不能站立行走，伴有四肢肌肉僵硬，于外院查血鉀2.3mmol/L，診斷為低鉀血癥，予補(bǔ)鉀治療后2d癥狀好轉(zhuǎn)。此后癥狀反復(fù)發(fā)作，毎于勞累后易發(fā)，1年2～3次不等，補(bǔ)鉀后癥狀均能緩解。10d前四肢乏力再發(fā)，伴有咳嗽、咯痰。追問(wèn)病史，患者8年前開(kāi)始出現(xiàn)反復(fù)意識(shí)不清，近2年逐漸加重，進(jìn)食后可緩解，未予正規(guī)診治。入院體檢：BP115/70mmHg，BMI 19.8，精神疲軟，咽輕微充血，甲狀腺I(mǎi)度腫大，質(zhì)中，未觸及結(jié)節(jié)，無(wú)壓痛，隨吞咽上下活動(dòng)。雙肺呼吸音清，未聞及干濕啰音。心率76次/min，律齊，未聞及病理性雜音。腹軟，中上腹深壓痛，肝脾肋下未及。無(wú)顏面及雙下肢水腫。左大腿后部可捫及一15cm×15cm腫塊，質(zhì)軟，邊界清，基底部寬，無(wú)壓痛，活動(dòng)度尚可。四肢肌張力正常，足背動(dòng)脈搏動(dòng)正常，病理征陰性。實(shí)驗(yàn)室檢查：T31.52ng/ml，F(xiàn)T32.98 pg/ ml，TSH 1.69μIU/ml；血常規(guī)：WBC 7.4×109/L，血鉀2.24mmol/L，血鈣 2.89mmol/L，血糖 1.8mmol/L，PTH 179pg/ml，胃泌素1 292.9pg/ml，臥位醛固酮219.5pg/ml，立位醛固酮1 318.9pg/ml。立、臥位試驗(yàn)顯示，患者血清腎素活性臥位5.25ng/（ml·h）[參考標(biāo)準(zhǔn)：0.05～0.79ng/（ml· h）]，立位2.74ng/（ml·h）[參考標(biāo)準(zhǔn)：1.95～3.99ng/（ml· h）]，血管緊張素臥位64.36 pg/ml（參考標(biāo)準(zhǔn)：28.2～52.5pg/ml），立位＞800ng/ml（參考標(biāo)準(zhǔn)：55.3～115.2 ng/ ml）。心電圖示竇性心率，ST-T改變，Q-T間期延長(zhǎng)。B超：甲狀腺右葉中級(jí)背側(cè)21cm×11cm低回聲光團(tuán)。右腎鈣化灶，雙腎多發(fā)結(jié)石，右腎盂積水，膀胱占位病變。ECT示甲狀旁腺腺瘤。MRI：雙腎上腺占位，轉(zhuǎn)移瘤可能大，胰頭形態(tài)不規(guī)則增大，腫瘤可能，左腎多發(fā)結(jié)石，右壺腹型腎盂，脾臟、肝臟小結(jié)節(jié)低密度灶（圖1）。膀胱CT：膀胱右側(cè)底部占位，前列腺鈣化。予補(bǔ)鉀、對(duì)癥治療，住院期間出現(xiàn)解水樣便伴惡心、嘔吐，顏面潮紅，大便常規(guī)陰性，培養(yǎng)無(wú)殊，考慮類(lèi)癌綜合征，加用奧曲肽抑制胰液分泌，賽庚啶抗5-HT治療后，腹瀉好轉(zhuǎn)，無(wú)惡心、嘔吐，無(wú)多飲、多尿，但一般情況差，精神萎。復(fù)查電解質(zhì)示血鉀 2.2mmol/L，血鈉 126mmol/L，游離鈣1.52mmol/L，患者及家屬拒絕胃鏡及相關(guān)病理檢查，自動(dòng)出院?；颊吒改讣?妹1弟均體健，育有2女1子，1女兒13年前死于“腎上腺腫瘤（性質(zhì)不詳）”。家系圖譜見(jiàn)圖2。

圖1 先證者及其兒子的影像學(xué)表現(xiàn)（a、b：先證者的MRI顯示胰頭形態(tài)不規(guī)則增大；c、d：先證者兒子的腹部CT顯示有左腎上腺腺瘤）

1.2 方法

1.2.1 家系調(diào)查 對(duì)患者進(jìn)行家系調(diào)查。

圖2MEN1患者的家系圖

1.2.2 分子生物學(xué)檢查 抽取先證者及5位一級(jí)親屬外周抗凝血5ml，采用標(biāo)準(zhǔn)的酚/氯仿抽提法提取人血白細(xì)胞基因組DNA。對(duì)MEN基因的10個(gè)外顯子進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引物序列用Primer Express2.0軟件進(jìn)行設(shè)計(jì)，擴(kuò)增片段包括10個(gè)外顯子區(qū)域以及外顯子和內(nèi)含子的交界區(qū)，產(chǎn)物長(zhǎng)度為367～717bp。引物序列見(jiàn)表1。20μl PCR反應(yīng)體系含基因組DNA 500 ng，寡核苷酸引物各0.5μl（100 pmol/L）。dNTP 0.5μl（200pmol/L），Taq DNA聚合酶2U及10×緩沖液2μl PCR反應(yīng)參數(shù)：92℃預(yù)變性5min，92℃變性30s，60℃退火35s，72℃延伸60s，共35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物蝦減酶純化后，應(yīng)用ABI3730測(cè)序儀進(jìn)行直接基因測(cè)序。樣本均經(jīng)雙向測(cè)序，結(jié)果完全一致。

表1MEN1基因篩查引物

2 結(jié)果

2.1 分子生物學(xué)檢查結(jié)果 對(duì)5位一級(jí)親屬進(jìn)行基因篩查，發(fā)現(xiàn)患者及其兒子在MEN基因的第7號(hào)內(nèi)含子的剪切位點(diǎn)上存在T→G的雜合突變（IVS7+2 T→G），其余外顯子及附近內(nèi)含子區(qū)域經(jīng)測(cè)序未發(fā)現(xiàn)突變（圖3）。其余家系成員包括患者的父母以及患者同胞弟弟和妹妹均未發(fā)現(xiàn)攜帶該基因突變。

圖3 患者M(jìn)EN1基因外顯子7與內(nèi)含子7交界處測(cè)序結(jié)果

2.2 家系調(diào)查和隨訪結(jié)果 先證者的父母及1妹1弟均體健，先證者育有2女和1子。據(jù)家屬告知1女兒16歲起病，當(dāng)時(shí)有高血壓、腹痛、腹瀉等表現(xiàn)，外院影像學(xué)檢查疑為“腎上腺腫瘤”，未經(jīng)特殊治療，后死亡。另一女兒暫無(wú)明顯內(nèi)分泌異常的表現(xiàn)。

先證者的兒子，30歲。在我們進(jìn)行基因診斷時(shí)，尚無(wú)明顯的臨床表現(xiàn)。2009年11月起出現(xiàn)晨起時(shí)意識(shí)障礙，呼之不應(yīng)，四肢能活動(dòng)，但動(dòng)作不協(xié)調(diào)，伴有大量出冷汗，每次持續(xù)半小時(shí)后意識(shí)轉(zhuǎn)請(qǐng)，有頭暈、頭痛，約3～5d發(fā)作一次，查FPG1.61mmol/L，血鉀3.83mmol/L，血鈉140mmol/L，血鈣2.27mmol/L，甲狀旁腺素49.1pg/ml，空腹胰島素62mIU/L，臥位醛固酮154.80 pg/ml，立位醛固酮198.9pg/ml，血漿腎素活性10.28ng/ml/h，ACTH（上午8：00）18.8pg/ml，皮質(zhì)醇（上午8：00）11.8 μg/dl，皮質(zhì)醇（午夜0：00）7.1 μg/dl，24h尿皮質(zhì)醇376.72μg，患者的血電解質(zhì)、性激素和甲狀腺功能均正常。腹部CT檢查發(fā)現(xiàn)左腎上腺結(jié)節(jié)和胰腺頸部腫塊（圖1）。于2010年1月行胰腺腫瘤及左腎上腺腫瘤切除術(shù)，術(shù)后FPG5.5 mmol/L，空腹胰島素27.9mIU/L。病理：胰腺內(nèi)分泌腫瘤（3.5cm×2.5cm×1.5cm），左腎上腺皮質(zhì)腫瘤（1.0cm× 0.8cm×0.5cm），免疫組化CK（+）、CgA（+）、Syn（+）、CD56（+）、Ki-67（+）（10%）、EMA（-）。對(duì)胰腺腫瘤進(jìn)行胰島素和胰高糖素的免疫組化顯示，胰島素染色陽(yáng)性，而胰高糖素的染色為陰性（圖4）。

3 討論

MEN是一組以多個(gè)不同的內(nèi)分泌腺在同一個(gè)體先后或同時(shí)發(fā)生、以功能亢進(jìn)為主要表現(xiàn)的遺傳性疾病。最近Lemons等[3]報(bào)道在MEN1患者中，最常見(jiàn)的為甲狀旁腺腺瘤導(dǎo)致的高鈣血癥，在95%的患者中出現(xiàn)，40%的患者發(fā)生胰腺胰島細(xì)胞腫瘤，包括胃泌素瘤、胰島細(xì)胞瘤、胰多肽瘤，而30%的患者發(fā)生泌乳素瘤、生長(zhǎng)激素瘤、ACTH瘤或無(wú)功能腺瘤等腺垂體腫瘤。同時(shí)，還發(fā)現(xiàn)在MEN1基因突變的攜帶者中，58%有臨床表現(xiàn)，13%有生化異常，而29%的攜帶者既無(wú)臨床表現(xiàn)也無(wú)生化異常。因此，有必要在MEN1的家系中進(jìn)行基因篩查，即使這些家系成員沒(méi)有明顯的臨床表現(xiàn)和生化異常。

圖4 胰腺和腎上腺腫瘤的組織學(xué)表現(xiàn)（a:胰腺腫瘤切片HE染色；b:腎上腺腫瘤切片HE染色；c:胰腺腫瘤胰高糖素染色陰性；d:胰腺腫瘤胰島素染色陽(yáng)性。a、b×200；c、d×400）

本研究的先證者表現(xiàn)為甲狀旁腺腺瘤、腸胰內(nèi)分泌腫瘤，且伴有廣泛轉(zhuǎn)移，左大腿部腫瘤可能為脂肪瘤。低血鉀的原因似乎與醛固酮升高有關(guān)，但患者無(wú)明顯高血壓表現(xiàn)，且其腎素-血管緊張素水平升高，考慮為腹瀉導(dǎo)致的容量不足導(dǎo)致繼發(fā)性醛固酮增多?；颊吲畠核烙谀I上腺腫瘤，發(fā)病年齡輕，當(dāng)時(shí)未對(duì)其他內(nèi)分泌腺體進(jìn)行檢查?；颊邇鹤釉诨蛟\斷時(shí)尚無(wú)明顯臨床表現(xiàn)，但7個(gè)月后出現(xiàn)了低血糖癥狀，經(jīng)進(jìn)一步檢查發(fā)現(xiàn)存在胰腺的β細(xì)胞瘤和左腎上腺的腫瘤。MEN1中最常見(jiàn)的內(nèi)分泌異常以甲狀旁腺和胰腺多見(jiàn)，腎上腺較為少見(jiàn)，據(jù)目前的報(bào)道為9%～55%，且多數(shù)為無(wú)功能性腫瘤。Schaefer等[4]通過(guò)超聲內(nèi)鏡技術(shù)發(fā)現(xiàn)MEN1中腎上腺累及的占73%，高于以往的報(bào)道，但僅有2例患者是有分泌活性的內(nèi)分泌系統(tǒng)累及（且為由于雙側(cè)腎上腺增生導(dǎo)致的非ACTH依賴(lài)性的Cushing綜合征）。先證者的腎上腺改變亦為雙側(cè)性，影像學(xué)表現(xiàn)支持轉(zhuǎn)移性腫瘤。此外，患者有嘔吐、腹瀉、潮紅和低血鉀表現(xiàn)，不能排除胰腺的VIP瘤或胃泌素瘤，但因先證者未經(jīng)手術(shù)治療，無(wú)病理學(xué)依據(jù)進(jìn)一步證實(shí)。

在不同的種族中，目前已確定生殖細(xì)胞水平的MEN1基因雜合突變是導(dǎo)致多發(fā)性?xún)?nèi)分泌腺瘤病的主要原因。MEN1基因位于染色體11q13，全長(zhǎng)9kb，包含10個(gè)外顯子，編碼含有610個(gè)氨基酸的蛋白minin[5]。目前認(rèn)為minin是一種腫瘤抑制因子，在成人的各種組織均有廣泛表達(dá)，與轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)、基因組的穩(wěn)定性、細(xì)胞的增殖和分裂密切相關(guān)。目前已報(bào)道的MEN突變有400余種，23%為無(wú)義突變，41%為導(dǎo)致移碼的缺失或插入，6%框內(nèi)缺失或插入，20%為錯(cuò)義突變,9%為剪切位點(diǎn)突變，1%為全部或部分基因的缺失[3，6-7]。國(guó)內(nèi)也有10余種突變類(lèi)型的報(bào)道，多為無(wú)義突變、錯(cuò)義突變、插入、缺失突變，但少有剪切位點(diǎn)的突變。Jiang等[8]報(bào)道的8個(gè)MEN家系中，發(fā)現(xiàn)了8種突變類(lèi)型，有373_374ins18，822delT，259delT，1092delC，357_360delCTGT，427_ 428delTA和R108X（CGA→TGA）。而Tso等[9]在臺(tái)灣報(bào)道的8個(gè)家系中，發(fā)現(xiàn)最常見(jiàn)的是插入突變1650insC（在3個(gè)家系檢測(cè)到），另外還有D418H（GAG→TAG），G110E（GGG→GAG），1 200del 11/ins 7 bp（del TTCTTTGAAGT）（ins ATCTACA）以及Intron 4，IVS4-9（G→A）。與MEN2a不同，中國(guó)人Ret基因突變存在突變熱點(diǎn)，均為密碼634突變，而MEN1突變散在分布，在目前中國(guó)大陸報(bào)道的患者中未發(fā)現(xiàn)帶有同樣突變的兩個(gè)家系。

本研究在一中國(guó)人家系中發(fā)現(xiàn)了內(nèi)含子7中存在剪切位點(diǎn)的突變，將導(dǎo)致MEN1基因mRNA剪切異常，從而影響minin蛋白的功能。由于真核基因轉(zhuǎn)錄后需要把內(nèi)含子切除而把外顯子連接起來(lái)才能產(chǎn)生成熟的mRNA分子，這個(gè)過(guò)程稱(chēng)為剪接。對(duì)400個(gè)脊椎動(dòng)物的基因進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，正確的剪切要求剪切小體識(shí)別特征性的共有序列。大部分內(nèi)含子的兩端分別是GT和AG，其中在內(nèi)含子5′端與外顯子交界的部位有一段保守序列,含有GT約為10bp（-4到+6），為mmAG GTrAGT（m為C或A，而r為A或G），被稱(chēng)為剪接供位（donor）；而在內(nèi)含子的3′端與外顯子的交界部位，也有一段保守的區(qū)域（-14到+1），包含AG及上游有一個(gè)富含嘧啶的區(qū)域，構(gòu)成剪接受位（acceptor）。此外，在內(nèi)含子近3′端，往往位于3′剪接位點(diǎn)的上游50個(gè)堿基左右的范圍內(nèi)，還有一個(gè)高度保守的堿基A，形成剪切時(shí)的分支點(diǎn)。這幾個(gè)部位堿基對(duì)mRNA的正確剪接具有重要的意義。此患者M(jìn)EN基因突變位于高度保守的剪切供位，將會(huì)對(duì)MEN基因mRNA的剪切產(chǎn)生影響，可能導(dǎo)致越過(guò)外顯子7，生成截短的minin蛋白。

最近Pieterman等[10]報(bào)道的74例MEN1患者中，其中30例經(jīng)基因診斷而無(wú)臨床表現(xiàn)的患者中，11例在隨訪的過(guò)程中發(fā)病，但無(wú)一例死亡，充分證明基因診斷作為一種簡(jiǎn)單易行的方法在MEN家系的早期診斷中起了重要的作用，并極大地改善了患者的長(zhǎng)期預(yù)后。因此，對(duì)MEN1的家系成員雖無(wú)臨床和生化異常，也應(yīng)常規(guī)進(jìn)行基因篩查，并制定一套完整的隨訪和檢測(cè)計(jì)劃，從而改善疾病的預(yù)后。

[1] Brandi M L,Marx S J,Aurbach G D,et al．Familial multiple endocrine neoplasia type I:a new look at pathophysiology[J]．Endocr Rev,1987,8:391-405．

[2] 李小英．多發(fā)性?xún)?nèi)分泌腺瘤病[J]．中國(guó)實(shí)用內(nèi)科雜志,2006,26(22): 1363-1366．

[3] Lemos M C,Thakker R V．Multiple endocrine neoplasia type 1 (MEN1):analysis of 1336 mutations reported in the first decade following identification of the gene [J]．Hum Mutat,2008,29: 22-32．

[4] Schaefer S,Shipotko M,Meyer S,et al．Natural course of small adrenal lesions in multiple endocrine neoplasia type 1:an endoscopic ultrasound imaging study[J]．Eur J Endocrinol,2008,158: 699-704．

[5] Larsson C,Skogseid B,Oberg K,et al．Multiple endocrine neoplasia type 1 gene maps to chromosome 11 and is lost in insulinoma[J]．Nature,1988,332:85-87．

[6] Wautot V,Vercherat C,Lespinasse J,et al．Germline mutation profile of MEN1 in multiple endocrine neoplasia type 1:search for correlation between phenotype and the functional domains of the MEN1 protein[J]．Hum Mutat,2002,20:35-47．

[7] Jap T S,Chiu C Y,Won J G S,et al．Novel mutations in the MEN1 gene in subjects with multiple endocrine neoplasia-1[J]．Clin Endocrinol,2005,62:336-342．

[8] Jiang X H,Lu J L,Cui B,et al．MEN1 mutation analysis in Chinese patients with multiple endocrine neoplasia type 1[J]．Endocrine-Related Cancer,2007,14:1073-1079．

[9] Tso A W,Rong R,Lo C Y,et al．Multiple endocrine neoplasia type 1 (MEN1):genetic and clinical analysis in the Southern Chinese [J]．Clin Endocrinol(Oxf),2003,59:129-135．

[10] Pieterman C R,Schreinemakers J M,Koppeschaar H P,et al．Multiple endocrine neoplasia type 1(MEN1):its manifestations and effect of genetic screening on clinical outcome[J]．Clin Endocrinol(Oxf),2009,70:575-581．

A novel splice site mutation of MEN1 gene detected in a pedigree of multiple endocrine neoplasia type 1

ObjectiveTo investigate mutations of MEN1 gene in a pedigree of multiple endocrine neoplasia type 1(MEN 1)．MethodsA patient with MEN 1 and his family members were enrolled in the study．Peripheral blood samples were collected and total genomic DNA was prepared for polymerase chain reaction(PCR)．PCR products of 10 exons of MEN1 gene were purified and gene sequence analysis was performed．ResultsA splice site mutation of intron 7(IVS7+2 T→G)were detected in the proband and his son,in whom clinical manifestations presented 7 months after genetic diagnosis,and insulinoma and left adrenal adenoma were then confirmed pathologically．ConclusionMEN1 patients may carry MEN1 mutations，which should be screened in their family members for early diagnosis and treatment．

Multiple endocrine neoplasia type 1 MEN1 gene Mutation

2012-02-06）

（本文編輯：沈昱平）

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（81070666）

323000 麗水市中心醫(yī)院內(nèi)分泌科（徐海燕、陳凱、夏蘇嬌）；上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院（喬潔、韓兵、郭郁郁、陸穎理、吳萬(wàn)齡）；上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院上海市內(nèi)分泌研究所（劉炳麗）

喬潔，E-mail：Qiaoj2001@126.com