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以適體作為載體介導siRNA 靶向運輸?shù)难芯窟M展

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小干擾RNA（siRNA）通過RNAi途徑沉默目的基因，因此其在疾病治療領(lǐng)域的應用受到關(guān)注。如今siRNA作為藥物應用于治療的主要問題是如何將siRNA靶向傳遞到目標細胞或組織。適體是一種體外合成的單鏈DNA或RNA寡核苷酸，由于對靶分子有高特異性、穿透力強、低免疫原性等特點，適體可作為載體用于藥物的靶向運輸。本文主要介紹用適體介導siRNA靶向傳遞的研究進展。

適體；siRNA；RNA干擾；靶向傳遞

隨著近些年科學技術(shù)的發(fā)展，基因治療、個體化醫(yī)療等逐漸成為討論的熱點。小干擾RNA（smallinterference RNA，siRNA）通過RNA干擾途徑抑制靶基因的表達；而適體具有高親和力、高特異性、穿透力強、分子量小等特點。二者同時皆是小分子核酸，免疫原性低，因此適體介導的siRNA干擾技術(shù)是一種靶向性強，副作用小的治療策略。

1 siRNA及其靶向運輸載體

siRNA是長約21～25 nt的雙鏈小分子RNA。siRNA通過RNA干擾（RNAi）途徑能夠使特定基因沉默或者表達水平降低[1]，從而阻斷某種特定蛋白質(zhì)的表達，因此siRNA具有成為新型核酸藥物的潛力。目前siRNA類藥物的研究已在多種疾病治療領(lǐng)域取得了較大的進展。如今應用這種新藥所面臨的難題主要是如何使siRNA安全并穩(wěn)定地傳送到病變的靶細胞或靶組織中去。

經(jīng)過多年的研究，已找到幾種siRNA體內(nèi)運輸載體。有乳糖化脂質(zhì)體[2]、膽固醇[3]、維生素E[4]、多肽[5]、由陽離子脂質(zhì)構(gòu)成的納米顆粒[6]以及抗體[7]和適體等。其中，乳糖化的脂質(zhì)體、膽固醇以及維生素E等可作為肝臟靶向載體，與siRNA結(jié)合，能有效地提高肝臟對siRNA的攝取[2,4]。但是這些載體不是針對某種特定的細胞，靶向性遠遠不如抗體和適體?？贵w和適體可以既是載體又是靶標分子的配體?？贵w由于具有高特異性，被認為是一種理想的送藥載體。但是抗體是一類大分子蛋白，具有潛在的免疫原性，進入機體后可能誘導機體產(chǎn)生免疫反應，有一定的毒副作用，限制了抗體在這方面的應用。適體被稱為是核酸形式的抗體，與抗體一樣，適體同樣具有對靶標分子的高特異性，但其分子量小，穿透力強，不存在明顯的免疫原性，所以作為靶向載體比抗體更安全。

2 靶向載體：適體

適體是通過體外合成的一種單鏈DNA或RNA寡核苷酸，經(jīng)體外指數(shù)富集的配體系統(tǒng)進化（systematic evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX）技術(shù)篩選得到[8]。近幾年來，適體技術(shù)發(fā)展迅速，已有許多不同的蛋白或者細胞的適體經(jīng)SELEX技術(shù)篩選得到?，F(xiàn)今，適體作為靶向載體的研究日益受到關(guān)注。

適體一般由19～80個堿基構(gòu)成，分子量為6～25 kDa。作為載體，適體具有以下幾點優(yōu)勢：第一，高特異性和高親和力。由于適體可折疊成獨特的二級結(jié)構(gòu)，從而具有特異、穩(wěn)定的立體構(gòu)象，所以適體對其靶標具有高特異性以及高親和力[8]，其特異性甚至高于抗體。第二，穿透性強，免疫原性低。適體是一種小分子物質(zhì)，更有利于其穿透組織或細胞，同時，適體無明顯免疫原性，不會對機體產(chǎn)生毒副作用，用藥更安全。第三，適體易于合成和修飾。如今適體已成功介導一些藥物在體外和體內(nèi)的靶向傳遞，這些藥物除了siRNA[15,18～21,30]，還包括抗癌藥[9～10]、毒素[11]、酶[12]、放射性核素[13]以及病毒[14]等等。

3 適體介導的siRNA傳遞

用適體介導siRNA傳遞，需要適體除了能特異性地與目的細胞上的靶分子結(jié)合，還能夠引發(fā)細胞的內(nèi)吞機制攜帶siRNA進入細胞。如今已有研究發(fā)現(xiàn)，幾種靶標分子的適體可進入表達該分子的細胞中。這些靶標有PSMA[22]、CD4[23]、HIV糖蛋白gp120[18]、細胞粘合素C（TN-C）[24]、蛋白酪氨酸酶（PTK7）[25]、鼠轉(zhuǎn)鐵蛋白受體（TfR）[12]、核仁素（NCL）[9]以及粘蛋白1（MUC1）[10]等等。近幾年來，多個小組對此進行了研究，利用針對CD30、CD4，PSMA、gp120等靶標的適體成功介導siRNA完成RNA干擾。最近的報道還介紹了針對B細胞激活因子受體（B cell activating factor-receptor，BAFF-R），以一段序列與siRNA相連，成功沉默了靶細胞的STAT3基因的表達[30]。

3.1 CD30適體介導的siRNA傳遞

CD30在間變性大細胞性淋巴瘤（anaplastic large cell lymphoma，ALCL）細胞表面特異性表達。間變性淋巴瘤激酶（anaplastic lymphoma kinase，ALK）基因是ALCL細胞內(nèi)特異表達的癌基因。Zhao等[6]用聚乙烯亞胺（PEI）和檸檬酸鹽構(gòu)成一個納米內(nèi)核，CD30的特異性核酸適體與目的基因為ALK的siRNA分別結(jié)合于PEI納米內(nèi)核的表面，形成一個納米復合物。其中，PEI是一種陽離子聚合物，具有高轉(zhuǎn)染效率，緩沖能力強，易于將核酸分子從核內(nèi)體釋放出來等優(yōu)點，是一類理想的傳遞siRNA的載體。實驗證明，納米復合物能特異地使ALCL細胞的ALK基因的表達降低。通過這種設(shè)計可以將不同的siRNA或者藥物通過納米復合物的形式作用于腫瘤細胞，起到協(xié)同治療的作用。因此，這種納米復合物具有臨床應用前景。

3.2 PSMA適體介導的siRNA傳遞

前列腺特異性膜抗原（prostate-speci fi c membrane antigen，PSMA）在原發(fā)性或者轉(zhuǎn)移性前列腺癌細胞中高表達，而在正常的前列腺上皮細胞中不表達。PSMA是一種跨膜蛋白，可被內(nèi)吞入細胞。Lupold等[22]用隨機RNA庫，以修飾后的胞外形式的PSMA為靶標，篩選出兩種適體，A9和A10。已有報道證明這2種適體都可進入細胞，有研究利用這兩種適體介導化療藥物、包被藥物的納米顆粒、毒素和siRNA等的靶向傳遞[11,15,16,26]。

Chu等[20]于2006年報道將靶標為PSMA的適體A9生物素化，而后分別與生物素化了的目的基因為A/C或GAPDH這兩種基因的siRNA通過生物素和鏈霉親和素之間的作用力結(jié)合，形成復合物。為了使得siRNA在進入細胞后更容易脫離出來，適體和siRNA之間以二硫鍵相連，當復合物進入細胞后，利用細胞內(nèi)的還原環(huán)境，可使二硫鍵斷裂，從而使siRNA解離。在細胞實驗的結(jié)果顯示，這個適體-生物素-鏈霉親和素-生物素-siRNA復合物成功沉默了表達PSMA的LNCap細胞中A/C以及GAPDH基因的表達，而對PSMA陰性細胞PC3不產(chǎn)生明顯的影響。這種方法雖然用適體成功將siRNA帶入靶細胞，并沉默目的基因，但是鏈酶親和素是大分子量的蛋白，進入機體后可能會誘導產(chǎn)生毒副作用。所以目前還無法應用于臨床治療。

McNamara等[16]找到另一種siRNA與適體的結(jié)合方式，即是直接將針對PSMA的適體A10與siRNA的正義鏈一起化學合成，形成長鏈，再將siRNA的反義鏈與長鏈中的siRNA正義鏈雜交，如此，通過共價鍵的形式相連形成嵌合體。在細胞實驗結(jié)果顯示，該嵌合體能特異地沉默LNCap細胞中的PLK1與BCL2基因。并且還通過動物實驗，發(fā)現(xiàn)將嵌合體直接注射入裸鼠攜帶的LNCap腫瘤中，腫瘤體積明顯減小，而PC3腫瘤未發(fā)現(xiàn)有明顯的變化。實驗結(jié)果證明了通過適體-siRNA結(jié)合體的連接方式，可成功介導siRNA靶向傳遞。這種嵌合體的成分只是RNA，具有免疫原性低，易于合成與修飾等優(yōu)點，有利于在體內(nèi)用藥。

在此基礎(chǔ)上，該研究小組對此嵌合體進一步優(yōu)化[15]。首先，他們將PSMA-siRNA嵌合體的適體部分A10由原來的71 nt變?yōu)?9 nt（A10-3.2），這樣不僅大大降低核酸合成的成本而且簡化了合成工序,有利于大規(guī)模的化學合成。第二步，在嵌合體長鏈的3'端加了2個尿嘧啶核苷酸尾（UU），這樣有利于細胞內(nèi)核酸內(nèi)切酶DICER的識別。第三步，將siRNA部分的正義鏈和反義鏈位置交換，并在正義鏈（即短鏈）上加20 kDa的聚乙二醇（PEG），這樣更有利于正確介導反義鏈進入RNA誘導的沉默復合體（RNA-induced silencing complex，RISC）。除此之外，20 kDa PEG使嵌合體的半衰期明顯延長,從而大大提高siRNA的沉默效率。由此，在細胞實驗中已驗證得出優(yōu)化后的結(jié)合體沉默效率提高了100倍。同時在動物實驗中又證明了通過全身用藥（腹腔注射）可使得腫瘤體積明顯減小，并且優(yōu)化后的嵌合體藥效更持久。

為了提高適體介導的siRNA靶向傳入細胞的效率，有研究將多個適體與siRNA相連。Wullner等[21]設(shè)計了兩種由二價PSMA適體和siRNA構(gòu)成的嵌合體。一種是把siRNA自身作為連接兩個適體的連接體，另一種是將siRNA分別于兩個適體的3'端。結(jié)果顯示，與單價的適體-siRNA相比，具有二價適體的嵌合體由于進入靶細胞的能力增強，因而提高了嵌合體對目的基因EEF2的沉默效率。

3.3 CD4適體介導的siRNA傳遞

CD4是在T淋巴細胞表面表達的一種糖蛋白。是HIV進入宿主細胞的主要受體。Th細胞過表達的CD4蛋白可被內(nèi)吞入細胞。Guo等[19]在2005年設(shè)計了一種利用噬菌體pRNA（packing RNA）將靶標為CD4的適體與siRNA結(jié)合的方法。pRNA的二級結(jié)構(gòu)具有5'/3'環(huán)狀結(jié)構(gòu)（L環(huán)與R環(huán)），兩個環(huán)狀結(jié)構(gòu)之間存在互補區(qū)域。將siRNA和適體分別與噬菌體pRNA相連，而后通過pRNA的環(huán)-環(huán)之間的堿基互補配對，siRNA與適體結(jié)合，形成二聚體。實驗證明，這個二聚體可進入CD4（+）T淋巴細胞，并且成功沉默了目的基因。

最近，Zhu等[29]將CD4的RNA適體轉(zhuǎn)變成DNA，二者被證明有相似的二級結(jié)構(gòu)。將DNA形式的適體與siRNA直接化學合成，形成嵌合體。實驗結(jié)果表明該DNA形式的適體具備與RNA適體相似的高親和性和特異性，并成功介導了siRNA進入表達CD4的T細胞。

3.4 gp120適體介導的siRNA傳遞

gp120蛋白是HIV-1表面的囊膜蛋白，是一種糖蛋白，在HIV病毒與宿主細胞融合的過程中起著重要作用，當gp120與T細胞膜表面的CD4結(jié)合后，引發(fā)HIV-1進入細胞[27]。已有研究證明，gp120蛋白的適體能與HIV-1 gp120結(jié)合并且進入細胞，因此，gp120適體也是能夠攜帶siRNA進入細胞的載體。Zhou等[17]將gp120適體與沉默HIV-1tat/rev基因的siRNA共價合成，為了降低空間位阻的影響，適體和siRNA之間存在一個4 nt的銜接子（linker）。由于gp120適體具有阻止HIV感染宿主細胞的功能，而siRNA又可通過RNA干擾途徑沉默目的基因HIV-1tat/rev，所以這種嵌合體具有雙重抗病毒作用。

Zhou等[28]設(shè)計了一種富含GC的“粘性寡核苷酸橋”。即是在適體的3'端通過化學合成，加上富含GC的一段寡核苷酸鏈。同時在siRNA的3'端加上與之互補的一段寡核苷酸鏈。二者通過互補配對相連。這種設(shè)計可以增加結(jié)合體的靈活性，不影響適體與siRNA各自的結(jié)構(gòu)，并且在不影響適體結(jié)合細胞功能的前提下，使不同的siRNA與適體相連。除此之外，通過這種設(shè)計方法，將來可能擴展到把多個siRNA與一個適體相連，成為一種具有多重效應的多價嵌合體。

4 面臨的問題與展望

用適體作為載體介導siRNA傳遞技術(shù)無疑為許多疾病的治療提供新的治療策略。但此技術(shù)目前還不成熟，其應用于臨床主要面臨如下幾大問題：第一，一些復合物/嵌合體進入體內(nèi)后可能會誘導機體對其產(chǎn)生免疫反應，存在潛在的危險性，所以要通過一些修飾優(yōu)化或找到一種新的安全的載體來降低或者除去其免疫原性。第二，復合物/嵌合體在血清中會被核酸酶降解，因此要通過一些修飾來提高復合物/嵌合體的穩(wěn)定性。第三，如今通過SELEX技術(shù)篩選出來的適體種類、數(shù)量有限，因此適體介導siRNA傳遞這項技術(shù)就只能對少數(shù)相應的幾種疾病有效，大大限制了適體-siRNA復合物/嵌合體在臨床上的應用。因此需要在未來建立一種新的篩選技術(shù)或改進現(xiàn)有的篩選技術(shù)以篩選出更多的針對不同靶標的適體。第四，適體-siRNA嵌合體一般是通過化學合成相連，如今的核酸合成技術(shù)只適用于合成小規(guī)模的寡核苷酸，而長鏈核酸的大規(guī)模、高質(zhì)量化學合成目前還難以達到。因此要經(jīng)過生物信息學分析后，將適體-siRNA嵌合體在不影響其功能的前提下長度盡量達到最短以簡化合成工序并且節(jié)約成本。

5 總結(jié)

siRNA能通過RNA干擾途徑沉默目的基因，是一類具有應用前景的基因類藥物。但是用siRNA治療疾病還存在靶向傳遞等問題。適體由于其具有高特異性，高親和力等特點，是一種理想的介導siRNA靶向傳遞載體。但是，目前通過SELEX篩選技術(shù)得到的適體有限，需要在將來找到更有效的篩選技術(shù)篩選更多的適體，尤其是能夠進入細胞的適體。除此之外，適體與siRNA如何相連也是研究的熱點。這里要考慮到適體與siRNA連接產(chǎn)物不會影響到適體和siRNA各自的功能，甚至是增強其各自的功能，并且在體內(nèi)給藥時不容易被降解，同時不會引起機體產(chǎn)生免疫反應導致副作用等。如今，已有幾種連接方法在細胞或動物實驗證明有明顯的治療效果，但依然存在許多問題，需要從各方面優(yōu)化，以用于臨床。相信突破這些瓶頸，適體-siRNA復合物/嵌合體能廣泛用于臨床治療。

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Research progress on aptamers as vector mediated siRNA targeted delivery

ZHANG Shimeng1, LIU Fei2, ZHENG Lei1, WANG Qian1★
(1.Laboratory Medicine Center, Nanfang Hospital, Southern Medical University, Guangdong, Guangzhou 510515, China; 2.Clinical Laboratory, Guangzhou Women and Children's Medical Center, Guangdong, Guangzhou 510623, China)

Small interfering RNA (siRNA) lead to gene silencing through RNA interference (RNAi) approach, which should be paid attention to the applicaion of disease treatment. Now the main problem about siRNA as drugs in disease treatment is how to transfer siRNA targeting to the target cell or tissue. Aptamer, a kind of single-stranded DNA or RNA oligonucleotides synthesized in vitro, has the characteristics of high speci fi city, strong penetrating, low immunogenicity, which can be used as vector for targeting delivery. This review mainly introduces the development of aptamer mediated siRNA delivery.

Aptamer; siRNA; RNA interference; Targeted delivery

1.南方醫(yī)科大學南方醫(yī)院，廣東，廣州 510515

2.廣州市婦女兒童醫(yī)療中心檢驗部，廣東，廣州 510623

★通訊作者：王前，E-mail: wangqian@ fi mmu.com