蔣衛(wèi) 韓穎 吳曉松 吳慧群 施菊妹

●論 著

體外擴(kuò)增人NK細(xì)胞及其對(duì)白血病細(xì)胞殺傷作用的研究

蔣衛(wèi) 韓穎 吳曉松 吳慧群 施菊妹

目的 通過(guò)體外擴(kuò)增人NK細(xì)胞的方法，探討擴(kuò)增后NK細(xì)胞對(duì)K562和HL60白血病細(xì)胞株的體外殺傷作用及機(jī)制。方法抽取5例健康志愿者外周血，分離單個(gè)核細(xì)胞（PBMC），與基因修飾K562細(xì)胞共同培養(yǎng)，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)NK細(xì)胞的表型，鉻51釋放法測(cè)定NK細(xì)胞對(duì)白血病細(xì)胞的殺傷率。結(jié)果基因修飾K562細(xì)胞在體外刺激NK細(xì)胞擴(kuò)增202倍；擴(kuò)增后NK細(xì)胞對(duì)白血病細(xì)胞K562、HL60的殺傷率分別為77.1%、61.2%（效/靶比為8∶1），擴(kuò)增前NK細(xì)胞對(duì)K562、HL60殺傷率分別為39.0%、35.4%；擴(kuò)增后NK細(xì)胞表面活化受體NKG2D、NKp30和NKp44表達(dá)增強(qiáng)；這些活化受體特異抗體能部分抑制擴(kuò)增后NK細(xì)胞的抗白血病作用。結(jié)論基因修飾K562細(xì)胞刺激NK細(xì)胞有效擴(kuò)增，擴(kuò)增后NK細(xì)胞殺傷白血病細(xì)胞作用明顯增強(qiáng)，擴(kuò)增后NK細(xì)胞表面部分活化受體上調(diào)可能為擴(kuò)增后NK細(xì)胞抑制白血病作用增強(qiáng)的分子機(jī)制，NK細(xì)胞治療在白血病中有潛在的應(yīng)用前景。

自然殺傷細(xì)胞 擴(kuò)增 白血病

【 Abstract】 ObjectiveThis study is to investigate the method for expansion of human NK cells in vitro.We also tested the role of expanded NK cells in killing of K562 and HL60 leukemia cells and its mechanism.MethodsPeripheral blood mononuclear cells (PBMC)were isolated from peripheral blood donored by 5 healthy individuals.PBMC were co-cultured with irradiated genetic modified K562 cell transfectants for 14 days.The cultures were then analyzed for fold expansion and cytotoxicity by flow cytometry and 51Cr-release assays.ResultsThis co-culture system could effectively expand NK cells (by a mean of 202 folds).The expanded NK cells killed K562 and HL60 cells avidly as shown by 51Cr-release assays.The mean cytotoxic rate of expanded NK cells against leukemia cells was 77.1%(K562),61.2%(HL60)at an E∶T ratio of 8∶1 compared to 39.0%(K562), 35.4% (HL60)of non-expanded NK cells,respectively.There was no killing of auto-and allo-PBMC.We observed stronger expression of activating receptor NKG2D,NKp30,NKp44 in expanded NK cells than in non-expanded NK cells.These specific antibodies could partly inhibited the enhanced lysis of K562 cells by expanded NK cells.ConclusionK562 transfectants can stimulate vigorous expansion of NK cells,and the expanded NK cells had an enhanced cytotoxic effect against leukemia cells. Up-regulation of activating receptors on expanded NK cells may be the mechanisms of enhanced killing of leukemia cells by expanded NK cells.NK cell therapy may be used for immunotherapy of leukemia.

急性白血病預(yù)后差，絕大部分患者治療效果不滿意[1]。近年來(lái)NK細(xì)胞在腫瘤過(guò)繼免疫治療方面的作用倍受關(guān)注，在白血病治療中取得了顯著的療效[2-3]。早在2002年Ruggeri等[4]報(bào)道的臨床研究結(jié)果，57例急性髓系白血病（AML）患者接受單倍體相合去T細(xì)胞移植后，其中20例有供者NK細(xì)胞抑制性受體和患者白血病細(xì)胞配體（L）不相合的患者經(jīng)隨訪，5年后復(fù)發(fā)率為0，然而其對(duì)照組相合的患者復(fù)發(fā)率為75%，表明供者NK細(xì)胞抑制性受體與腫瘤細(xì)胞表面配體不合的NK細(xì)胞在患者體內(nèi)發(fā)揮了有效的抗白血病作用。但限制這些過(guò)繼性免疫療法的一個(gè)重要因素是無(wú)法獲得足量的高活性NK細(xì)胞。目前如何擴(kuò)增NK細(xì)胞和如何調(diào)控NK細(xì)胞功能，以增強(qiáng)NK細(xì)胞的抗腫瘤效應(yīng)方面的研究已經(jīng)成為熱點(diǎn)[5-6]。本研究探討了體外擴(kuò)增健康人NK細(xì)胞的方法，觀察擴(kuò)增后NK細(xì)胞對(duì)白血病細(xì)胞株的殺傷作用及其機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞株和試劑 RPMI 1640細(xì)胞培養(yǎng)液為美國(guó)Gibco公司產(chǎn)品。熒光標(biāo)記抗體CD3、CD14、CD19、CD33、CD14、CD56、KIR2DL1、KIR2DL2/3、KIR3DL1均為美國(guó)BD公司產(chǎn)品。anti-NKG2D、anti-NKp30、anti-NKp44、anti-NKp46抗體購(gòu)自美國(guó)BD公司。CD3、CD56磁珠購(gòu)自德國(guó)美天旎公司?；蛐揎椇蟊磉_(dá)膜結(jié)合白介素（IL）-15和4-1BB（CD137）配體（L）的K562細(xì)胞株（K562-mb15-41BBL）為同濟(jì)大學(xué)附屬第十人民醫(yī)院實(shí)驗(yàn)室保留細(xì)胞，K562和HL60白血病細(xì)胞株購(gòu)自美國(guó)Type Culture Collection（Manassas,VA）。

1.2 方法

1.2.1 外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMC）分離 抽取5例健康志愿者外周靜脈血50 ml，收集于肝素抗凝管中，用淋巴細(xì)胞分離液以密度梯度離心法分離外周血PBMC，磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌3次。

1.2.2 NK細(xì)胞擴(kuò)增 PBMC與輻照后K562-mb15-41BBL（輻照劑量為100Gy）按1∶1.5的比例混合培養(yǎng)，培養(yǎng)液中含300 U/ml IL-2，在共培養(yǎng)的第7天，再以輻照后的細(xì)胞株刺激NK細(xì)胞擴(kuò)增，擴(kuò)增時(shí)同樣條件復(fù)種3孔，置37℃、5%CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2d半量換液，加入新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，并使得IL-2的終濃度為300 U/ml。于培養(yǎng)前和培養(yǎng)第14天采用錐蟲(chóng)藍(lán)染色法計(jì)算總活細(xì)胞數(shù)，總活細(xì)胞數(shù)除以初始細(xì)胞數(shù)，求出實(shí)際擴(kuò)增倍數(shù)。

1.2.3 流式細(xì)胞儀分析 取待標(biāo)記的細(xì)胞1×106，分別加入10μl的熒光抗體，室溫避光孵育20min后，PBS洗滌3次，通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表面分子的表達(dá)情況。

1.2.4 4h-鉻（Cr）51釋放法 采用Cr51釋放試驗(yàn)測(cè)定NK細(xì)胞殺傷率，用Cr51標(biāo)記靶細(xì)胞1.5 h，培養(yǎng)液洗滌靶細(xì)胞3次。運(yùn)用mini磁性細(xì)胞分選器（MACS）免疫磁珠分選，純化NK細(xì)胞，NK細(xì)胞的純度約95%。NK細(xì)胞功能阻斷實(shí)驗(yàn)，采用單獨(dú)或聯(lián)合應(yīng)用針對(duì)NK細(xì)胞表面受體（NKG2D、NKp30和NKp44）的特異抗體阻斷其表面表達(dá)的受體，觀察阻斷這些受體后對(duì)NK細(xì)胞殺傷率的影響。NK細(xì)胞與靶細(xì)胞按一定比例（見(jiàn)結(jié)果部分）混合于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板培養(yǎng)（37℃,5%CO2）4 h，每個(gè)效/靶比均設(shè)3個(gè)平行孔，收集上清液。應(yīng)用γ計(jì)數(shù)儀測(cè)定上清液中放射量（以cpm值表示）。特異性殺傷率（%）=（樣本cpm值-背景cpm值）/最大釋放cpm值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以表示，擴(kuò)增前后比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)，每組數(shù)據(jù)至少重復(fù)3次實(shí)驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 健康人外周血單個(gè)核細(xì)胞中NK細(xì)胞的擴(kuò)增情況 通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)，混合培養(yǎng)后NK細(xì)胞（CD3-CD56+）數(shù)量較混合培養(yǎng)前擴(kuò)增了約202倍（范圍：67～366）；擴(kuò)增后的細(xì)胞中NK細(xì)胞顯著富集，擴(kuò)增前（第0天）NK細(xì)胞平均含量12%（范圍：4.8%～20.1%）；擴(kuò)增后（第14天）NK細(xì)胞平均含量87.1%（范圍：80.1%～94.3%），擴(kuò)增后NK細(xì)胞含量與擴(kuò)增前比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。同時(shí)，NKT細(xì)胞（CD3+CD56+）平均擴(kuò)增了3.5倍（范圍：0.4～6.8，P＞0.05），但擴(kuò)增后NKT細(xì)胞較擴(kuò)增前無(wú)顯著的富集（第0天平均5.0%，范圍：0.8%～8.4%；第14天平均5.2%，范圍：3.4%～6.4%）。與NK細(xì)胞、NKT細(xì)胞對(duì)照，T細(xì)胞（CD3+CD56-）含量明顯減少（第0天平均60.9%，范圍：48.4%～66.1%；第14天平均5.2%，范圍：0.9%～11.3%）。混合培養(yǎng)體系主要細(xì)胞成分的含量見(jiàn)表1；NK細(xì)胞和NKT細(xì)胞擴(kuò)增前和擴(kuò)增后的分布情況見(jiàn)圖1。

2.2 體外擴(kuò)增前后NK細(xì)胞對(duì)白血病細(xì)胞殺傷作用比較 在NK細(xì)胞與白血病細(xì)胞的比例為8∶1時(shí)，擴(kuò)增后NK細(xì)胞對(duì)K562細(xì)胞株的殺傷率（平均77.1%，范圍：70.1%～89.2%）顯著高于擴(kuò)增前NK細(xì)胞對(duì)該細(xì)胞株的殺傷率（平均39.0%，范圍：32.9%～48.6%，P＜0.05）。在NK細(xì)胞與HL60細(xì)胞的比例為8∶1時(shí)，擴(kuò)增后NK細(xì)胞對(duì)HL60細(xì)胞株的殺傷率（平均61.2%，范圍：55.6%～70.7%）顯著高于擴(kuò)增前NK細(xì)胞對(duì)HL60細(xì)胞的殺傷率（平均35.4%，范圍：33.4%～38.6%，P＜0.05）。擴(kuò)增后NK細(xì)胞對(duì)自體和異體PBMC幾乎無(wú)細(xì)胞毒性作用，平均殺死率＜5%。5例健康志愿者擴(kuò)增前和擴(kuò)增后NK細(xì)胞對(duì)K562、HL60細(xì)胞的殺傷率見(jiàn)圖2。結(jié)果提示擴(kuò)增后NK細(xì)胞對(duì)白血病細(xì)胞株的殺傷作用顯著增強(qiáng)。

表1 擴(kuò)增后培養(yǎng)體系中主要細(xì)胞成分

圖1 擴(kuò)增前和擴(kuò)增后NK細(xì)胞和NKT細(xì)胞的分布

圖2 5例志愿者擴(kuò)增前和擴(kuò)增后的NK細(xì)胞對(duì)K562、HL60細(xì)胞的殺傷率

2.3 擴(kuò)增后NK細(xì)胞表面活化性受體表達(dá)情況 擴(kuò)增后NK細(xì)胞表面殺傷細(xì)胞活化受體例如NKG2D、NKp30和NKp44表達(dá)增強(qiáng)，NKp46活化分子無(wú)顯著變化。但是，NK細(xì)胞表面的主要抑制性受體如KIR2DL1、KIR2DL2/L3和KIR3DL1表達(dá)無(wú)明顯變化，提示擴(kuò)增后NK細(xì)胞表面的NKG2D、NKp30和NKp44活化性受體表達(dá)增強(qiáng)，可能使得擴(kuò)增后NK細(xì)胞具有較強(qiáng)的抑制白血病作用。擴(kuò)增前和擴(kuò)增后NK細(xì)胞表面的主要活化性受體和抑制性受體表達(dá)情況見(jiàn)圖3。

2.4 擴(kuò)增后NK細(xì)胞抗白血病作用的變化 anti-NKG2D、anti-NKp30、anti-NKp44、anti-NKp46和anti-NKG2D、anti-NKp30、anti-NKp44的3種抗體混合液對(duì)擴(kuò)增后NK細(xì)胞殺傷K562細(xì)胞有阻斷作用，NK細(xì)胞殺傷功能的平均抑制百分率分別為36.2%（anti-NKG2D）、25.4%（anti-NKp30）、23.8%（anti-NKp44）、3.9%（anti-NKp46）和68.3%（anti-NKG2D和anti-NKp30和anti-NKp44）（n=3）。

3 討論

AMC的預(yù)后較差，尤其是對(duì)不耐受大劑量化療藥物或不適合移植的患者，所以迫切需要新的治療方法來(lái)緩解患者病情。研究表明，NK細(xì)胞介導(dǎo)的移植物抗腫瘤（GVT）作用可以增加抗腫瘤作用；NK細(xì)胞對(duì)于樹(shù)突狀細(xì)胞的清除可以阻斷移植物抗宿主病（GVHD）的發(fā)生；NK細(xì)胞可以通過(guò)去除受者的T淋巴細(xì)胞以利于移植物的植入，減少了骨髓毒性藥物的用量，縮短了中性粒細(xì)胞減少的時(shí)間，NK細(xì)胞治療在清除AML細(xì)胞和allo-HSCT中有重要作用[4]，有望成為緩解AML新的治療手段，具有較好的臨床應(yīng)用前景[7]。Miller等[8]給予未經(jīng)移植19例不良預(yù)后的AML患者同種異體NK細(xì)胞及IL-2的聯(lián)合輸注，結(jié)果顯示，同種異體NK細(xì)胞輸注有較好的耐受性，患者體內(nèi)的供者NK細(xì)胞有擴(kuò)增，且沒(méi)有發(fā)生GVHD，其中5例（26%）獲得了形態(tài)學(xué)緩解，進(jìn)一步研究患者與供者的殺傷細(xì)胞抑制性受體-配體相容性發(fā)現(xiàn)，5例形態(tài)學(xué)緩解患者中4例具有殺傷細(xì)胞抑制性受體-配體不相容性，在這4例患者中3例獲得完全緩解。在高危AML和兒童急性淋巴細(xì)胞白血病中，殺傷細(xì)胞抑制受體-配體不相容的同種異體NK細(xì)胞能降低白血病的復(fù)發(fā)率，顯著提高患者的無(wú)事件生存率[9]，這說(shuō)明選擇殺傷細(xì)胞抑制受體-配體不相容的供者可有助于在未來(lái)的臨床試驗(yàn)中獲得成功，同種異體NK細(xì)胞可以持續(xù)存在并可在體內(nèi)擴(kuò)增[8]，可以單獨(dú)或聯(lián)合造血干細(xì)胞移植用于治療某些血液系統(tǒng)腫瘤。

圖3 擴(kuò)增前和擴(kuò)增后NK細(xì)胞表面的受體表達(dá)情況

雖然NK細(xì)胞治療取得了可喜的成績(jī)，但由于NK細(xì)胞來(lái)源少、抗腫瘤活性低和增殖力低下等因素制約了NK細(xì)胞免疫治療的廣泛應(yīng)用[10]。我們運(yùn)用基因修飾后表達(dá)膜結(jié)合IL-15和4-1BB（CD137）配體的K562細(xì)胞刺激健康人PBMC中未經(jīng)富集的NK細(xì)胞，能刺激NK細(xì)胞擴(kuò)增約202倍，擴(kuò)增后培養(yǎng)體系中NK細(xì)胞含量87%，與擴(kuò)增前NK細(xì)胞含量12%相比較，NK細(xì)胞有明顯富集。近年來(lái)國(guó)內(nèi)外對(duì)體外擴(kuò)增NK細(xì)胞進(jìn)行了研究，Voskens等[11]報(bào)道，運(yùn)用K562-mb15-41BBL刺激NK細(xì)胞擴(kuò)增約165倍，與我們的結(jié)果相似。

NK細(xì)胞表面有兩類不同功能受體：即殺傷細(xì)胞活化受體和殺傷細(xì)胞抑制受體。NK細(xì)胞對(duì)髓系白血病細(xì)胞的殺傷主要通過(guò)以下機(jī)制：一種是通過(guò)NK細(xì)胞表面表達(dá)的受體DNAM-1去識(shí)別相應(yīng)的配體如PVR（CD155）和Nectin-2（CD112），從而激活NK細(xì)胞；另一種是通過(guò)NK細(xì)胞上KIRs和靶細(xì)胞上的HLA不相容性識(shí)別并殺傷靶細(xì)胞。此外，NK細(xì)胞的細(xì)胞毒性受體（NCRs:NKp30、NKp44、NKp46）和共刺激分子也參與其抗腫瘤作用。通過(guò)鉻51NK細(xì)胞殺傷試驗(yàn)，我們發(fā)現(xiàn)，效/靶比8∶1時(shí)，擴(kuò)增后NK細(xì)胞對(duì)K562、HL60細(xì)胞的殺傷率分別為77.1%和61.2%，顯著高于擴(kuò)增前NK細(xì)胞對(duì)K562、HL60細(xì)胞的殺傷率（K562細(xì)胞殺傷率為39.0%，HL60細(xì)胞殺傷率為35.4%）。但擴(kuò)增后NK細(xì)胞對(duì)健康人自體和異體PBMC無(wú)明顯殺傷作用。流式細(xì)胞儀分析NK細(xì)胞表面受體，結(jié)果顯示NKG2D、NKp30和NKp44活化受體明顯上調(diào)，我們進(jìn)一步運(yùn)用特異性抗體，驗(yàn)證了NKG2D、NKp30和NKp44活化受體上調(diào)可能是擴(kuò)增后NK細(xì)胞抗腫瘤作用增強(qiáng)的主要因素。當(dāng)聯(lián)合應(yīng)用這些阻斷抗體時(shí)，未能完全抑制NK細(xì)胞殺傷功能，提示擴(kuò)增后NK細(xì)胞表面活化受體NKG2D、NKp30和NKp44上調(diào)在擴(kuò)增后NK細(xì)胞抗白血病中起重要作用，但其他活化受體的上調(diào)表達(dá)可能在抗白血病作用中也具有一定的作用。

綜上所述，基因修飾的K562細(xì)胞能刺激NK細(xì)胞擴(kuò)增，擴(kuò)增后NK細(xì)胞對(duì)K562和HL60白血病細(xì)胞株的殺傷作用顯著增強(qiáng)，擴(kuò)增后NK細(xì)胞表面活化受體NKG2D、NKp30和NKp44表達(dá)增強(qiáng)，可能為擴(kuò)增后NK細(xì)胞抑制白血病作用增強(qiáng)的分子機(jī)制，本研究為白血病及其他NK細(xì)胞敏感腫瘤的治療新途徑提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)，具有潛在的臨床應(yīng)用前景。

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（本文編輯：馬雯娜）

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本刊編輯部

Expansion of human natural killer cells with specific cytotoxicity against leukemia cells in vitro

Natural killer cells Expansion Leukemia

2013-07-24）

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200072 上海，同濟(jì)大學(xué)附屬第十人民醫(yī)院血液科（蔣衛(wèi)、韓穎均為第一作者）

施菊妹，E-mail：shijumei@hotmail.com