鄭建瓊 陳育梅 馮國飛 黃凌霄 潘丹 朱雪燕 朱雪瓊

肥大細胞在人乳頭瘤病毒感染導(dǎo)致宮頸鱗癌發(fā)生發(fā)展中的作用研究

鄭建瓊 陳育梅 馮國飛 黃凌霄 潘丹 朱雪燕 朱雪瓊

目的 觀察人乳頭瘤病毒（HPV）和肥大細胞（MC）在正常宮頸組織、宮頸上皮內(nèi)瘤變（CIN）及宮頸鱗癌（SCC）組織中的表達。方法 采用S-P免疫組化法檢測60例CIN患者、40例SCC組患者和20例子宮肌瘤患者（對照組）組織中MC的表達，同時采用DNA導(dǎo)流雜交基因芯片技術(shù)檢測各級組織脫落細胞中HPVDNA分型。結(jié)果 隨著宮頸病變程度的加重，高危型（HR）-HPV感染陽性率逐漸增加，分別為10%、55%、65%、85%、100%，其中最常見的高危型HPV感染的基因型為：16、58、52、18。與CIN III組比較，MC密度在CINⅡ組、SCC組、對照組中的表達明顯升高（P＜0.01或0.05），并且MC與腫瘤臨床分期和血管轉(zhuǎn)移有關(guān)（均P＜0.05）。MC低表達者與高表達者間HR-HPV陽性率的差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。 結(jié)論 HR-HPV感染可以降低MC的表達，癌組織中浸潤的MC可以促進腫瘤血管的形成和腫瘤的浸潤轉(zhuǎn)移。

宮頸鱗癌 宮頸上皮內(nèi)瘤變 人乳頭瘤病毒 肥大細胞

宮頸癌是一種常見的婦科腫瘤，嚴重威脅廣大女性的生命和健康。全世界每年有37萬新發(fā)病例，有20萬人死亡；中國每年新發(fā)病例13萬，占全世界的1/3[1]。宮頸癌病因很多，目前認為只有高危型人乳頭瘤病毒(high risk human papillomavirus,HR-HPV)持續(xù)感染才是導(dǎo)致宮頸上皮惡性轉(zhuǎn)化的必要條件。宿主的免疫反應(yīng)對HPV感染轉(zhuǎn)歸起決定性作用，直接影響到HPV感染是否被清除或轉(zhuǎn)為持續(xù)性感染[2]。肥大細胞（mast cell，MC）是體內(nèi)重要的間質(zhì)炎性細胞，不僅可以發(fā)揮非特異性免疫功能，而且可以促進腫瘤血管新生，并參與構(gòu)建腫瘤的微環(huán)境[3]。本研究中，筆者觀察MC在各級宮頸組織中的表達情況，研究其與宮頸鱗癌（squamous cell carcinoma，SCC）的臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系，同時檢測各宮頸組織脫落細胞中HPV DNA情況，研究兩者的相關(guān)性，為治療HPV感染導(dǎo)致的SCC提供新的理論依據(jù)。

1 對象和方法

1.1 對象 選擇2012-01—06因患宮頸上皮內(nèi)瘤變（cervical intraepithelial neoplasia，CIN）在溫州市人民醫(yī)院婦產(chǎn)科行宮頸電環(huán)切術(shù)（loop electrosurgical excisional procedure，LEEP）或全子宮切除術(shù)的60例患者，年齡24～66歲，平均（46.47±8.42）歲。均無合并其他內(nèi)外科疾病，術(shù)后病理檢查診斷為CINⅠ20例，CINⅡ20例，CINⅢ20例。選擇2010-09—2012-12因患SCC在溫州市人民醫(yī)院婦產(chǎn)科行全子宮切除術(shù)或廣泛子宮切除術(shù)加盆腔淋巴結(jié)清掃術(shù)的40例患者，年齡33～71歲，平均（47.92±9.61）歲。均無合并其他內(nèi)外科疾病，術(shù)前未進行過放化療，術(shù)后經(jīng)病理檢查證實，組織學(xué)分級中、高分化21例、低分化19例；FIGO臨床分期[4]≤Ib 22例，≥IIa 18例；浸潤深度（浸潤至深肌層）＜3cm 25例，≥3cm 15例；伴有血管轉(zhuǎn)移13例，無血管轉(zhuǎn)移27例；伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移14例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移26例。選擇2012-01—06因患子宮肌瘤在溫州市人民醫(yī)院婦產(chǎn)科行全子宮切除術(shù)的20例患者作為對照組，年齡43～75歲，平均（52.35± 8.27）歲。均無合并其他內(nèi)外科疾病。

1.2 方法

1.2.1 HPV DNA的檢測 取材時機：LEEP術(shù)患者于門診婦科檢查時，其他SCC患者于住院行婦科檢查時。取材方法：以窺陰器暴露宮頸，擦去宮頸口黏液，將宮頸刷置于宮頸口，順時針旋轉(zhuǎn)5圈；取出宮頸刷，放入已加有專用細胞保存液的取樣管中，擰緊瓶蓋。樣本處理：將有樣本的微量離心管以14 000 r/min離心5min，棄上清液，保留管底沉淀物，加入50μl裂解液懸浮沉淀，100℃加熱10min，14 000r/min離心10min，取上清液待檢。采用DNA導(dǎo)流雜交基因芯片技術(shù)檢測HPV DNA，HPV分型基因芯片檢測系統(tǒng)（上海凱普生物化學(xué)有限公司）一次性檢測21種HPV亞型的基因分型，包括13種高危亞型：16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68，5種低危亞型：6、11、42、43、44，3種中國人群常見亞型：53、66和CP8304。

1.2.2 MC的檢測

1.2.2.1 S-P免疫組化法 一抗為小鼠抗人類胰蛋白酶（Tryptase）單克隆抗體（美國Neomarkers公司）。切片脫蠟入水，3%過氧化氫阻斷過氧化物酶活性10min；PBS洗滌5min，3次；組織抗原微波修復(fù)，高溫5min，中高溫5min，室溫20min；PBS洗滌5min，3次；相應(yīng)的一抗4℃過夜，PBS洗滌5min，3次；生物素標記二抗室溫孵育30min；DAB顯色，顯微鏡觀察,水洗終止；蘇木素復(fù)染；樹脂封片，光鏡下觀察。每次實驗均設(shè)陰性和陽性對照。以PBS代替一抗作陰性對照，用已知有表達的宮頸癌切片作為陽性對照。

1.2.2.2 結(jié)果判斷 MC類胰蛋白酶陽性者表達于間質(zhì)細胞的胞質(zhì)，呈棕褐色。肥大細胞密度（mast cell density，MCD）采用Orii等[5]方法，連續(xù)計數(shù)20個高倍視野（×400）的MC個數(shù)，再計算每個高倍視野下MC的平均數(shù)。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS14.0統(tǒng)計軟件。計量資料以表示，多組間比較采用One-Way ANOVA檢驗，兩兩比較采用LSD法。SCC組中各臨床病理參數(shù)之間差異的比較采用成組t檢驗。宮頸各級組織中MC低表達組和高表達組HR-HPV陽性率的比較采用χ2檢驗。

2 結(jié)果

2.1 宮頸各級病變組織中HPV分型情況 對照組中多重陽性1例；CINⅠ和CINⅡ組中，多重陽性各有3例；CINⅢ組中，多重陽性7例；SCC組中，多重陽性5例。隨著宮頸病變程度的加重，HR-HPV感染陽性率呈遞增趨勢，分別為10%、55%、65%、85%、100%，其中最常見的HR-HPV感染的基因型為16、58、52、18，詳見表1。

表1 宮頸各級病變組織中HPV DNA分布情況（例）

2.2 各級宮頸病變組織中MC表達情況 與CINⅢ組比較，MC在CINⅡ組、SCC組、對照組中的表達明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01或0.05），詳見圖1、表2。

2.3 SCC組患者各臨床病理分期組織的MCD 在SCC組患者各臨床病理分期組織中，MCD僅與不同臨床分期、血管是否轉(zhuǎn)移有關(guān)，高臨床分期者高于低臨床分期者，有血管轉(zhuǎn)移者高于無血管轉(zhuǎn)移者，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05），詳見表3。

2.4 宮頸各級組織中MC低表達者和高表達者HRHPV感染情況 宮頸各級組織中MCD為0～10不等，平均4.13，設(shè)0～4為低表達者，共77例；5～10為高表達者，共43例。MC低表達者HR-HPV陽性率為77.92%，高表達者陽性率為53.49%，兩者間的差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=7.72，P＜0.01），詳見表4。

圖1 肥大細胞在宮頸各病變組織中的表達（A：正常宮頸組織；B：CINⅠ組織；C：CINⅡ組織；D：CINⅢ組織；E：SCC組織；SP法，×400）

表2 宮頸各級病變中MCD的表達情況

表3 SCC組患者MC表達情況

表4 MC低表達和高表達者HR-HPV感染情況（例）

3 討論

3.1 HPV和SCC的關(guān)系 HPV是一種無包膜的小DNA病毒，具有雙鏈閉環(huán)的DNA基因組，大小為7.2～8.0kb，相對分子量為5×106，編碼8個主要開放讀碼框架（ORFs），分為3個功能區(qū)：（1）早期區(qū)（E區(qū)），約4～5kb，含E1～E7 6個亞區(qū)；（2）晚期區(qū)（L區(qū)），約2.5kb，含L1、L2兩個亞區(qū)；（3）非調(diào)控區(qū)（UCR），位于L區(qū)末端與E區(qū)起始端之間，一般為800～900bp。E區(qū)由E1、E2、E4、E5、E6、E7 6個開放閱讀框架組成,主要功能為參與病毒復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、翻譯、調(diào)控與細胞轉(zhuǎn)化。機體感染HPV后，其E6、E7致癌基因與抑癌基因pRB和p53結(jié)合，p53、pRB的功能受到抑制，細胞分化發(fā)生S期阻滯，最終細胞增殖失控，病毒的DNA斷裂，部分DNA片段整合到宿主細胞基因組DNA中，從而使病毒E2基因失活，失去了對E6、E7基因的轉(zhuǎn)錄抑制調(diào)節(jié)，E6、E7基因得以持續(xù)表達，細胞轉(zhuǎn)化為惡性。病毒基因的表達由病毒和宿主細胞的轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控，包括E2、調(diào)控區(qū)（LCR）及細胞內(nèi)反式調(diào)節(jié)因子，它們的改變可使轉(zhuǎn)化蛋白過表達而致腫瘤[6]。至今已鑒定一百二十多種HPV基因型。世界衛(wèi)生組織根據(jù)HPV亞型致癌危險性高低，可將HPV分為低危型和高危型兩大類：（1）低危型：主要引起肛門皮膚及外生殖器的外生性疣類病變和低度子宮頸上皮內(nèi)瘤變，其病毒亞型主要有HPV 6、11、30、39、42、43、44型等。（2）高危型：除可引起外生殖器疣外，更重要的是引起外生殖器癌、子宮頸癌及高度子宮頸上皮內(nèi)瘤變，其病毒亞型主要有HPV l6、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66、68、73型等，其中感染率最高的是HPV16和HPV18型，引起SCC的常為HPV16型，引起宮頸腺癌的常為HPV18型。目前認為，有性行為的女性約80%曾感染過HPV。感染HPV后，通常6～12個月內(nèi)可自行消退。1年后HPV持續(xù)陽性率為30%，2年后為9%。只有HR-HPV持續(xù)感染才是導(dǎo)致宮頸癌的必要條件，其中對機體感染HPV后是否被清除或轉(zhuǎn)為持續(xù)性感染，起決定性作用的是宿主的免疫反應(yīng)[2]。HPV感染導(dǎo)致SCC的發(fā)病因素還包括：病毒的DNA存在形式、病毒負荷量、宿主免疫反應(yīng)、遺傳易感性、宿主性激素水平、合并其他病毒感染等。

朱麗丹等[7]利用DAN雜交技術(shù)檢測2 561例溫州地區(qū)婦科門診和住院病例的下生殖道HPV并進行基因分型，HPV總陽性率為26.08%（668/2 561），高危型HPV與低危型HPV各占檢出構(gòu)成比的87.3%和12.7%,高危型HPV陽性率在CINⅠ、CINⅡ、CINⅢ、宮頸癌中分別為31.6%、53.1%、63.5%、75.0%，高危型中以16型最多（23.6%），其次為52型（16.3%）、58型（15.0%）。隨著宮頸病變程度的加重，HR-HPV感染陽性率有遞增趨勢，分別為10%、55%、65%、85%、100%，其中感染前4位基因型為16、58、52、18，提示HR-HPV持續(xù)感染是宮頸癌發(fā)生的必要條件，與上述研究結(jié)果稍有差別，可能是本研究樣本量太少有關(guān)。

3.2 MC和SCC的關(guān)系 MC來源于骨髓CD34+造血干細胞，是一類廣泛分布于哺乳動物體內(nèi)，以胞質(zhì)中包含多種活性介質(zhì)的嗜堿性顆粒為特征的細胞。不同亞型的MC胞漿中含有的蛋白酶存在差異。MCT型含有類胰蛋白酶，MCTC型含有類胰蛋白酶和類糜蛋白酶?；罨蟮腗C可合成和分泌血管活性介質(zhì)、趨化性介質(zhì)、蛋白酶及細胞因子等40余種生物活性物質(zhì)，參與體內(nèi)多種生理和病理過程，如生殖、免疫、速發(fā)型變態(tài)反應(yīng)、寄生蟲感染和腫瘤等[8-9]。

關(guān)于MC和宮頸癌的關(guān)系，目前報道不一。Bentez-Bribiesca等[10]觀察到類胰蛋白酶陽性的MC數(shù)量從正常子宮頸組織到子宮頸浸潤癌逐漸增加。然而Cabanillas-Saez等[11]報道在CIN的Ⅰ～Ⅲ級中,MC數(shù)目無統(tǒng)計學(xué)差異，而在子宮頸浸潤癌中MC數(shù)目較正常子宮頸組織有明顯的提高。Karpanen等[12]報道，MC可以分泌血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）-A與血管內(nèi)皮細胞上的VEGF-2受體結(jié)合，主要促進腫瘤血管的生成，導(dǎo)致宮頸癌的浸潤轉(zhuǎn)移。關(guān)于宮頸癌中MC的具體分型，也有不同的報道。Cabanillas-Saez等[11]發(fā)現(xiàn)在正常宮頸組織和宮頸癌組織中主要以MCT型為主，并且在宮頸病變惡性轉(zhuǎn)化的不同時期MC的數(shù)量持續(xù)升高。然而Nicolae-Costin等[13]通過免疫組化方法分析SiHa細胞和ME-180細胞MC表達情況時發(fā)現(xiàn)，在宮頸浸潤癌中，MTC表型占75%～79%，MCT表型僅占21%～25%，遠遠低于以前的研究報道（以前的研究報道占80%～83%），同時發(fā)現(xiàn)，類糜蛋白酶，而不是類胰蛋白酶，可以引起腫瘤細胞的遷移，從而導(dǎo)致腫瘤的轉(zhuǎn)移。

本研究發(fā)現(xiàn)，與CINⅢ組比較，MC在CINⅡ組、SCC組、對照組中的表達明顯升高（P＜0.01或0.05）。在CINⅢ組中的表達最低，原因可能為：HPV感染和MC表達有關(guān)，持續(xù)的HPV感染會降低MC表達；但進展為SCC時，腫瘤微環(huán)境的改變，如MCP-1、巨噬細胞的增加，導(dǎo)致MC增加，促進腫瘤的浸潤轉(zhuǎn)移。本研究發(fā)現(xiàn)，在宮頸癌各臨床病理分期中，MC表達與不同臨床分期、血管轉(zhuǎn)移有關(guān)，提示MC可以作為宮頸癌血管轉(zhuǎn)移的預(yù)測指標之一。而對于具體的亞型，由于本研究使用的是小鼠抗人類胰蛋白酶單克隆抗體標計MC，MCTC和MCT表型均可以表現(xiàn)為陽性，尚不能區(qū)分具體分型。

3.3 MC和HPV的關(guān)系 MC參與機體抗HPV感染的非特異性免疫功能。其既可以吞噬殺傷病原菌或異質(zhì)細胞，又能夠釋放多種生物活性介質(zhì)，介導(dǎo)炎性反應(yīng)。同時，由于MC存活時間長，有時可達數(shù)年，能對同一刺激做出重復(fù)性應(yīng)答，因而對病原體、腫瘤有免疫監(jiān)視及效應(yīng)[14]。本研究發(fā)現(xiàn)，MC低表達組HR-HPV陽性率為77.92%，高表達組HR-HPV陽性率為53.49%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），提示HR-HPV的持續(xù)感染，可以下調(diào)MC的表達，促進宮頸上皮向惡性轉(zhuǎn)化。

綜上所述，HR-HPV持續(xù)感染是宮頸癌發(fā)生的必要條件，可以降低MC的表達，促進宮頸上皮向惡性轉(zhuǎn)化；但在宮頸癌階段，MC可以促進腫瘤血管新生，促進宮頸癌的浸潤轉(zhuǎn)移。進一步研究MC的功能及其與HPV之間的關(guān)系，必將有助于我們深入了解其在HPV感染導(dǎo)致的SCC癌變中的作用，為治療SCC提供新的思路。

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The role of mast cells in progression of squamous cervical cancer induced by HPV infection

ZHENG Jianqiong,CHEN Yumei,FENG Guofei，et al.
Department of Gynecology，Wenzhou People's Hospital，Wenzhou 325000,China

Objective To investigate the expression of human papillomavirus(HPV)and mast cells(MCs)in normal cervical tissue，cervical intraepithelial neoplasia(CIN)and squamous cervical carcinoma(SCC). Methods The streptavidin peroxidase (SP)immunohistochemical staining was used to detect the expression of MCs in 20 specimens of normal cervical squamous epithelial tissue,60 specimens of CIN tissue and 40 specimens of SCC tissue．The HPV typing in exfoliated cells was determined by DNA diversion hybrid gene chip technique. Results The positive rates of HPV infection in normal cervical tissue,CIN I,CIN II,CIN III and SCC were 10%,55%,65%,85%and 100%,respectively.The most common genotypes of high risk HPV(HR-HPV) infection were:16,58,52 and 18.Compared to CINIII,the mast cell density(MCD)in CINⅡ,normal tissue and SCC was significantly increased(P＜0.05 or 0.01);the MCD was correlated the clinical stage of tumor and the metastasis of blood vessel(P＜0.05).There was significant difference in infection rate of HR-HPV between high MCD group and low MCD group(P＜0.01). Conclusion HR-HPV infection is associated with the down-regulation of MC expression,indicating that infiltrating MC in cancer tissue may promote the tumor angiogenesis,invasion and metastasis.

Squamous cervical carcinoma Cervical intraepithelial neoplasm HPV Mast cell

2013-03-08）

（本文編輯：嚴瑋雯）

溫州市科技局項目（Y20120037）

325000 溫州市人民醫(yī)院婦產(chǎn)科（鄭建瓊、陳育梅、黃凌霄、朱雪燕），病理科（馮國飛、潘丹）；溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院婦產(chǎn)科（朱雪瓊）

朱雪瓊，E-mail：zjwzzxq@163.com