王 毅 馬玉蘭 巫 娟 曾慶華 李羅翔 李 娟

年齡相關(guān)性黃斑變性（age-related macular degeneration，AMD）是黃斑區(qū)光感受器、視網(wǎng)膜色素上皮（retinal pigment epithelium，RPE）、Bruch 膜和脈絡膜毛細血管的慢性進行性變性，隨著年齡增長發(fā)病率增加，是發(fā)達國家導致不可逆視野缺損和失明的主要原因〔1〕。 世界衛(wèi)生組織的研究報告表明，AMD致盲約占全球盲人的8.7%，全球約有3 000 萬AMD患者，每年約有50 萬人因AMD 致盲〔2〕。 在我國，由于人口老年化進程的加劇和飲食結(jié)構(gòu)的變化， 其他致盲原因得到或加強了控制，AMD 日益成為重要致盲的眼病。 AMD 發(fā)病機理尚未明確，遺傳因素和環(huán)境因素的共同作用是AMD 主要的發(fā)病原因〔3〕，血脂異常作為重要危險因素之一，越來越受到研究者關(guān)注，遺傳學的研究證實AMD 的發(fā)生與載脂蛋白E（APOE）基因密切相關(guān)〔4〕。 ApoE-/-小鼠模型是研究動脈粥樣硬化和神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病的常用模型，我們前期實驗通過觀察血脂異常ApoE-/-小鼠視網(wǎng)膜外核層厚度、色素上皮細胞層厚度及Bruch 膜改變，發(fā)現(xiàn)血脂異常ApoE-/-小鼠視網(wǎng)膜和Bruch 膜的病理改變與AMD 病理改變一致〔5〕，為更好闡明血脂異常ApoE-/-小鼠模型可作為研究AMD 動物模型，我們進一步觀察了血脂異常ApoE-/-小鼠模型視網(wǎng)膜外核層細胞、色素上皮細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)和細胞數(shù)目改變及Bruch 膜的組織形態(tài)改變，結(jié)果報告如下。

1 材料和方法

1.1 材料

實驗用2 月齡的雄性普食C57BL 小鼠和以C57BL 為背景的ApoE-/-小鼠，分別由四川大學華西實驗動物中心（動物合格證：川實動管質(zhì)第09 號）和北京大學實驗動物中心（美國Jackson 實驗室引進）提供。普通飼料和高脂飼料均由成都達碩動物實驗有限公司提供。 所有實驗根據(jù)赫爾辛基宣言和保護及運用動物的指導原則來進行。

1.2 動物造模與分組

實驗分為3 組，將24 只ApoE-/-小鼠根據(jù)體重分層隨機分為：2 月齡ApoE-/-高脂組和2 月齡ApoE-/-普食組，每組12 只；另用12 只2 月齡C57BL普食組作為對照組。高脂組動物予高脂飼料，普食組動物予標準嚙齒類動物飼料，飼料與水均自由攝取，所有動物在裝有清潔過濾器的籠子中飼養(yǎng)，溫度保持在22℃～25℃，相對濕度50%，保持12 小時，晝夜循環(huán)，共喂養(yǎng)至4 月～6 月齡。

1.3 觀察指標及測試方法

1.3.1 血漿總膽固醇、低密度脂蛋白檢測：禁食8 小時后，在動物宰殺前靜脈注射鎮(zhèn)靜劑戊巴比妥鈉，用肝素化的采血管采集股靜脈血。使用日立7170 全自動生化分析儀檢測血漿總膽固醇（TC）、低密度脂蛋白（LDL）。

1.3.2 視網(wǎng)膜光感受器細胞和Bruch 膜組織形態(tài)觀察：摘出小鼠左眼，每組共12 只眼球，保留約1～2 mm 長視神經(jīng)，用鋒利的刀片在角鞏緣處切一三角形小口，放入FAA（酒精-甲醛-醋酸）液中固定1周，切取含視神經(jīng)的冠狀面眼球壁組織3～5 mm 厚，逐級酒精脫水、石蠟包埋，切片4 um，行Masson 三色染色。 Masson 染色結(jié)果為：細胞核呈紅色，光感受器細胞核呈鮮紅色，Bruch 膜呈藍綠色，纖維組織為綠色，脈絡膜呈特有的黑色。 光鏡下觀察染色切片，首先在低倍視野下（100×）觀察眼球壁各層組織結(jié)構(gòu)，然后在中倍（200×）下觀察視網(wǎng)膜光感受器細胞和色素上皮層細胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)，選擇視盤兩端視網(wǎng)膜、脈絡膜各5 個視野，共計10 個視野，采用Mias2000 圖像分析系統(tǒng)（四川川大智勝軟件股份有限公司）半定量檢測視網(wǎng)膜光感受器細胞核的面積；每個視野光感受器細胞核面積，表示光感受器細胞數(shù)；上述10個視野色素上皮細胞核的數(shù)目， 表示色素上皮細胞數(shù)；另外每幅圖像10 次測量Bruch 膜厚度，取100次測量的平均值表示Bruch 膜厚度。 最后用高倍（400×）觀察Bruch 膜結(jié)構(gòu)和有無玻璃膜疣形成。

1.3.3 色素上皮細胞和Bruch 膜的超微結(jié)構(gòu)觀察：摘取小鼠右眼，每組取2 只眼球，經(jīng)30ml/L 戊二醛預固定，10g/L 四氧化鋨再固定， 丙酮逐級脫水，Epon812 包埋，半薄切片光學顯微鏡下定位，超薄切片，醋酸鈾及枸酸鉛雙重染色，H-600Ⅳ型透射電鏡觀察。

1.4 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 17.0 統(tǒng)計學軟件進行統(tǒng)計分析。 本研究實驗指標的數(shù)據(jù)資料以x±s 表示，3 個組小鼠血漿TC、LDL 濃度和光感受器細胞數(shù)、RPE 層細胞數(shù)及Bruch 膜厚度的差異均采用單因素方差分析，組間的多重比較采用LSD-t 檢驗。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 三組小鼠血漿TC、LDL 的比較

6 月齡ApoE-/-高脂組小鼠血漿TC、LDL 均顯著高于6 月齡ApoE-/-普食組和6 月齡C57BL 普食組 （P＜0.001），6 月齡ApoE-/-普食組小鼠血漿TC、LDL 顯著高于6 月齡C57BL 普食組（P＜0.001)（表1）。

表1 三組小鼠血漿TC、LDL 值（x±s，mmol/L）

2.2 三組小鼠視網(wǎng)膜光感受器細胞、RPE 及Bruch膜的組織形態(tài)改變

光鏡下觀察Masson 三色染色切片可見ApoE-/-高脂組小鼠視網(wǎng)膜變薄，光感受器細胞和RPE 細胞

均排列紊亂、稀疏和細胞萎縮，Bruch 膜變厚或粗細不均、膠原分叉，膜中聚集有大小、多少不等的紅色無結(jié)構(gòu)物質(zhì)，即玻璃膜疣（圖1-A）；ApoE-/-普食組小鼠視網(wǎng)膜較薄，光感受器細胞和RPE 排列較紊亂、稀疏，細胞萎縮程度輕，Bruch 膜變厚或粗細不均、膠原分叉，但未見明顯玻璃膜疣形成（圖1-B）；C57BL 普食組小鼠視網(wǎng)膜未見變薄，光感受器細胞和RPE 排列較整齊，未見明顯細胞萎縮、稀疏，Bruch膜無變厚或粗細不均、無膠原分叉，未見玻璃膜疣出現(xiàn)（圖1-C）。半定量檢測結(jié)果顯示光感受器細胞數(shù)：ApoE-/-高脂組比ApoE-/-普食組及C57BL 普食組明顯減少，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；RPE 數(shù)：ApoE-/-高脂組比C57BL 普食組明顯減少 （P＜0.001），比ApoE-/-普食組減少，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；Bruch 膜厚度：ApoE-/-高脂組比ApoE-/-普食組及C57BL 普食組明顯增厚（P＜0.05，表2）。

2.3 視網(wǎng)膜RPE 和Bruch 膜超微結(jié)構(gòu)改變

表2 三組小鼠光感受器細胞面積、RPE 數(shù)、Bruch 厚度值比較（x±s）

RPE：ApoE-/-高脂組色素上皮細胞基底膜皺褶變短且減少，胞質(zhì)內(nèi)線粒體腫脹，可見核邊聚，胞漿中可見大量空泡（圖2-A）；ApoE-/-普食組色素上皮細胞基底膜皺褶減少，胞質(zhì)內(nèi)線粒體輕度腫脹，可見核邊聚現(xiàn)象（圖2-B）；C57BL/6 普食組色素上皮細胞基底膜未見明顯皺褶，胞質(zhì)內(nèi)線粒體結(jié)構(gòu)基本正常（圖2-C）。Bruch 膜：ApoE-/-高脂組Bruch 膜明顯增厚，纖維結(jié)構(gòu)明顯減少，彈力層斷裂，出現(xiàn)大量空泡（圖2-A）。ApoE-/-普食組Bruch 膜纖維結(jié)構(gòu)不均勻，彈力層斷裂，有空泡出現(xiàn)（圖2-B）。 C57BL/6普食組Bruch 膜纖維結(jié)構(gòu)均勻，彈力層連續(xù)，未見明顯空泡（圖2-C）。

3 討論

病理學研究發(fā)現(xiàn)AMD 的發(fā)生與異常脂肪代謝及轉(zhuǎn)運相關(guān)〔6〕，Gaymer 研究證實高脂肪攝入與AMD發(fā)病風險增加有關(guān)〔7〕。 血脂異常可以導致視網(wǎng)膜色素上皮細胞的形態(tài)損害，Bruch 膜脂質(zhì)的沉著破壞其完整性并導致脈絡膜毛細血管內(nèi)皮細胞的病理改變〔8〕。Fritsche 等研究發(fā)現(xiàn)ApoE 基因多態(tài)性與AMD之間存在顯著相關(guān)性〔9〕，ApoE 是含有299 個氨基酸的磷脂糖蛋白，是組成脂蛋白的重要成分，其在調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝、維持膽固醇平衡方面起重要作用。 ApoE基因及基因啟動子具有多態(tài)性，啟動子的突變顯著降低ApoE 基因的表達并進而影響ApoE 蛋白的功能〔10〕，致ApoE-/-小鼠出現(xiàn)高脂血癥〔11〕。

因此，我們采用高脂飼料喂養(yǎng)ApoE-/-小鼠建立動物模型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ApoE-/-普食組小鼠血漿總膽固醇和低密度脂蛋白比C57BL 普食組明顯增高（P＜0.001），高脂組ApoE-/-小鼠血漿總膽固醇和低密度脂蛋白比ApoE-/-小鼠普食組顯著增高（P＜0.001）。實驗結(jié)果顯示ApoE 基因缺失可引起脂質(zhì)代謝障礙，導致小鼠高脂血癥，結(jié)果與Debernardi 等報道一致〔11〕，經(jīng)高脂喂養(yǎng)后血脂更高，這也與我們前期的研究結(jié)果一致〔12〕。

AMD 分為干性和濕性兩種類型，干性AMD 以視網(wǎng)膜光感受器和RPE 改變?yōu)樘卣鳎憩F(xiàn)為RPE及病變區(qū)的光感受器細胞萎縮，稱為地圖狀萎縮，玻璃膜疣形成，Bruch 膜增厚或粗細不等。 濕性AMD在具有干性AMD 病理改變基礎上，特征性的出現(xiàn)視網(wǎng)膜色素上皮下新生血管形成〔13，14〕。 我們通過高脂喂養(yǎng)ApoE-/-小鼠建立高脂血癥動物模型后觀察到，高脂組ApoE-/-小鼠視網(wǎng)膜光感受器細胞和色素上皮細胞排列紊亂、細胞萎縮，Bruch 膜變厚、粗細不等、膠原分叉，可見玻璃膜疣形成。 而作為對照組的C57BL 普食組小鼠視網(wǎng)膜光感受器細胞和色素上皮細胞、Bruch 膜均未見上述改變。 半定量檢測視網(wǎng)膜光感受器細胞、色素上皮細胞數(shù)，結(jié)果顯示高脂組ApoE-/-小鼠和普食組ApoE-/-小鼠視網(wǎng)膜光感受器細胞和色素上皮細胞數(shù)比普食組C57BL 小鼠明顯減少（P＜0.05-0.001），Bruch 膜厚度明顯增厚（P＜0.001）。超微結(jié)構(gòu)觀察進一步顯示高脂組ApoE-/-小鼠RPE 和Bruch 膜出現(xiàn)明顯損傷，表現(xiàn)為：RPE基底膜皺褶變短且減少，胞質(zhì)內(nèi)線粒體腫脹，可見核邊聚，胞漿中可見大量空泡，Bruch 膜明顯增厚，纖維結(jié)構(gòu)明顯減少，彈力層斷裂，出現(xiàn)大量空泡。 而作為對照組的普食組C57BL 小鼠視網(wǎng)膜RPE 基底膜未見明顯皺褶，胞質(zhì)內(nèi)線粒體結(jié)構(gòu)基本正常，Bruch膜纖維結(jié)構(gòu)均勻，彈力層連續(xù)，未見明顯空泡。 上述改變顯示高脂組ApoE-/-小鼠視網(wǎng)膜光感受器細胞、RPE 和Bruch 膜光鏡和電鏡下的組織形態(tài)改變符合AMD 的病理變化。

綜上所述，高脂血癥ApoE-/-小鼠視網(wǎng)膜光感受器細胞、色素上皮細胞及Bruch 膜發(fā)生了類似AMD的病理改變，可用該動物模型做AMD 的相關(guān)研究。

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