汪源　劉永忠　彭抒昂　胡先文

摘 要： 【目的】為了探索臍橙果皮精油氧化還原性與柑橘果實(shí)油胞下陷病害的關(guān)系，【方法】以奉節(jié)臍橙為試材，對(duì)奉節(jié)臍橙正常和油胞下陷病發(fā)生較嚴(yán)重的果實(shí)在病變過(guò)程中果皮精油的pH、維生素C含量、活性氧產(chǎn)生速率及抗氧化活性的變化情況進(jìn)行了分析?！窘Y(jié)果】結(jié)果表明，在整個(gè)貯藏過(guò)程中，奉節(jié)臍橙果皮油胞下陷病發(fā)生率和果皮精油pH隨貯藏時(shí)間的增加而上升，外皮組織中溢出的精油的氧化性使病變率顯著增加；正常果的果皮精油產(chǎn)生活性氧速率低于癥狀果，但抗氧化活性和維生素C含量高于癥狀果。【結(jié)論】說(shuō)明奉節(jié)臍橙精油氧化還原性是果皮油胞下陷病害的影響因素。

關(guān)鍵詞： 臍橙； 油胞下陷； 精油； 活性氧； 抗氧化活性

中圖分類號(hào)：S666.4 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1009-9980？穴2013？雪01-0094-05

重慶市奉節(jié)縣是我國(guó)柑橘的優(yōu)勢(shì)產(chǎn)區(qū)，但當(dāng)?shù)鬲?dú)特的土壤氣候條件也使柑橘易發(fā)生油胞下陷病，嚴(yán)重影響了柑橘果實(shí)的外觀，大幅度降低了果實(shí)的商品性能。柑橘油胞下陷?。ㄓ纸杏桶卟?、油胞病、油胞凹陷，英文名為Oil Spotting，Oleocellosis）是柑橘產(chǎn)區(qū)普遍發(fā)生的生理性病害[1-2]，在果實(shí)成熟期和采后貯藏期間發(fā)病較為嚴(yán)重，使果皮表面形成不規(guī)則的淺綠色或黃色、褐色病斑。病斑內(nèi)油胞明顯突出破裂，油胞間組織凹陷，進(jìn)而出現(xiàn)萎縮形成病狀。由于油胞枯萎主要發(fā)生在柑橘的黃皮層，所以油胞下陷病一般不會(huì)引起果實(shí)腐爛，但病斑易受青霉、綠霉菌侵染而導(dǎo)致果實(shí)變味腐爛，嚴(yán)重影響果實(shí)的外觀和商品性，導(dǎo)致其在市場(chǎng)上的售價(jià)遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于沒(méi)有患油胞下陷的果實(shí)，給我國(guó)柑橘種植戶造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失，嚴(yán)重制約了我國(guó)柑橘產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。

柑橘油胞下陷長(zhǎng)期不太受人關(guān)注，國(guó)內(nèi)外近年來(lái)的相關(guān)研究報(bào)道很少。有研究發(fā)現(xiàn)，柑橘油胞下陷病的發(fā)生與外部環(huán)境條件有著密切的關(guān)系[3-6]。如由于氣候變化如降雨、干旱或灌溉等原因，柑橘園土壤質(zhì)地、土壤肥力、植株?duì)I養(yǎng)水平和植株呼吸速率降低時(shí)，果實(shí)水份代謝失調(diào)，易導(dǎo)致該病的發(fā)生。Shomer等[7]研究發(fā)現(xiàn)，滲到橘皮下表層組織的橘油阻礙了葉綠素向成色素細(xì)胞的分化而發(fā)生病變。在病斑的形成與褐變過(guò)程中，細(xì)胞壁的破裂變形及氧化酶如PPO（多酚氧化酶）、CAT（過(guò)氧化氫酶）等也起到了重要的作用[8]。Sawamura等[9]研究發(fā)現(xiàn)，柑橘外皮組織中的油胞破裂后滲出的具有光毒性的橘油對(duì)果皮造成了傷害。油胞的橘油釋放壓和流出橘油毒性的大小與內(nèi)源激素GA3[10]和乙烯[11]等也有關(guān)。另外，較強(qiáng)的陽(yáng)光直射和果面高溫容易引起外果皮組織受損[12]，以及機(jī)械損傷在果皮上造成傷口，油胞中滲出的橘皮精油會(huì)使病斑進(jìn)一步擴(kuò)大。以前的研究多是關(guān)注如何通過(guò)控制采前條件來(lái)控制果實(shí)的病害，而事實(shí)上，即使采用健康的果實(shí)貯藏，在貯藏期依然會(huì)發(fā)生比較嚴(yán)重的油胞下陷病。目前，對(duì)柑橘果皮精油抗菌性研究較多，但對(duì)于果皮精油引起柑橘油胞下陷病及其氧化還原性與油胞下陷病的關(guān)系的研究少見報(bào)道。我們以‘奉節(jié)臍橙為試驗(yàn)材料，用外源精油處理臍橙，研究經(jīng)處理后臍橙油胞下陷的發(fā)生狀況及在貯藏過(guò)程中果皮精油活性氧的產(chǎn)生速率及病變過(guò)程中抗氧化指標(biāo)的變化情況，以探索外源精油氧化還原性對(duì)臍橙果皮油胞下陷病的影響，為有效防治油胞下陷提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

‘奉節(jié)臍橙（Citrus sinensis Osbeck）果實(shí)采于奉節(jié)縣一商業(yè)園，挑選新鮮無(wú)機(jī)械損傷，大小均一，成熟度一致的果實(shí)進(jìn)行分裝處理，于適宜溫度和濕度條件下貯藏。

1.2 方法

1.2.1 臍橙果皮精油的制備 根據(jù)Sawamura等[13]介紹的方法，稍做修改，具體方法為：將新鮮的正常臍橙果皮削去白皮層，放入5%左右的石灰水中浸泡8～16 h后，取出、洗凈。用雙手手指一點(diǎn)一點(diǎn)彎折外果皮使油泡破裂，讓精油射出，置于含飽和氯化鈉溶液的玻璃離心管管口的漏斗進(jìn)入離心管中（離心管放于冰浴里），用高速離心機(jī)在5 000 r·min-1下離心10 min，用吸管吸出上層液，加入無(wú)水硫酸鈉脫水，于5 ℃冰箱中放置過(guò)夜（注意保存），于5000 r·min-1下再離心10 min ，得冷壓精油A，用同樣的方法提取發(fā)生癥狀的臍橙果皮精油B。

1.2.2 臍橙果皮精油處理‘奉節(jié)臍橙果實(shí) 將無(wú)癥狀的、無(wú)機(jī)械損傷、大小均一、成熟度一致的果實(shí)洗果晾干后，進(jìn)行以下各種處理：（1）將臍橙精油滴加到水果包裝紙上，然后將其包裝臍橙；（2）直接將臍橙精油涂抹于臍橙果實(shí)表面；（3）用2%的維生素C處理后將臍橙精油涂抹于果實(shí)表面；（4）不做任何處理。4種方式每處理50個(gè)，處理后分別用厚度為0.02 mm的聚乙烯袋單果包裝，將其儲(chǔ)藏于4℃冰箱中。每周統(tǒng)計(jì)果皮油胞下陷病害的發(fā)生情況，3次重復(fù)。參照Knight等[8]的方法進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)分級(jí)及計(jì)算。油胞下陷級(jí)別：0為無(wú)；1為較輕微；2為輕微；3為中等；4為嚴(yán)重。

油胞下陷指數(shù)=∑（塌陷級(jí)別×該級(jí)別果實(shí)占總果實(shí)的百分比）

1.2.3 臍橙果皮精油pH的測(cè)定 在室溫下（16～25 ℃）用pH計(jì)對(duì)上述制備好的2種臍橙精油分別進(jìn)行測(cè)定，取3次結(jié)果的平均值，測(cè)定范圍為0～14，每周定期測(cè)定pH值并觀察顏色變化情況。

1.2.4 臍橙果皮精油活性氧產(chǎn)生速率的測(cè)定 參照王愛(ài)國(guó)等[14]的方法并加以改進(jìn)。取1.0 mL冷壓精油加入磷酸緩沖液（pH 7.8）1.0 mL和10 mmol·L-1鹽酸羥胺0.1 mL，在25 ℃混合并培養(yǎng)20 min。取0.5 mL培養(yǎng)液依次加入0.5 mL 17 mmol·L-1對(duì)氨基苯磺酸和0.5 mL 7 mmol·L-1 α-萘胺，在25 ℃反應(yīng)20 min，反應(yīng)后的顯色液用同體積正丁醇充分搖勻，離心分層，取正丁醇相在412 nm處測(cè)定樣品吸光值，用磷酸緩沖液代替樣品作空白。樣品重復(fù)測(cè)定3次，每周定期測(cè)定1次。活性氧產(chǎn)生速率以μmol·g-1·min-1表示。

1.2.5 臍橙果皮精油維生素C含量的測(cè)定

1）標(biāo)準(zhǔn)曲線。用鉬藍(lán)比色法測(cè)定，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線： 取7支25 mL容量瓶，依次加入0.00、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00、l.20 mL 維生素C標(biāo)準(zhǔn)液（1 g·L-1），然后加草酸-EDTA溶液10.00、9.80、9.60、9.40、9.20、9.00、8.80 mL，最后各管分別加入1.00 mL偏磷酸-醋酸，3.00 mL 6%硫酸，3.00 mL 6%鉬酸銨溶液。放置10 min顯色穩(wěn)定后，用1號(hào)空白為參比于840 nm波長(zhǎng)下測(cè)OD。以維生素C含量為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)做標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到曲線方程y=0.014x-0.004。

2）維生素C含量的測(cè)定。取精油1.00 mL于25 mL容量瓶中，依次加入9.00 mL草酸-EDTA溶液，1.00 mL偏磷酸-醋酸溶液，3.00 mL 6%硫酸，3.00 mL 6%鉬酸銨溶液，顯色，以蒸餾水為參比，于840 nm波長(zhǎng)下測(cè)OD。每周定期測(cè)定1次， 每次重復(fù)3次。

1.2.6 臍橙果皮精油抗氧化活性的測(cè)定 采用DPPH·清除能力來(lái)確定抗氧化效果[15]。稱取DPPH·試劑0.2561 g，無(wú)水乙醇溶解，轉(zhuǎn)入1 000 mL容量瓶中，無(wú)水乙醇定容，搖勻得濃度為256.1 mg·L-1 DPPH·儲(chǔ)備液（約6.5×104 mol·L-1 [16]），置于冰箱中冷藏備用，使用前用無(wú)水乙醇稀釋至濃度為25.61 mg·L-1。在最大波長(zhǎng)516 nm，按表1加樣測(cè)定各吸光值（A）。每一吸光度平行測(cè)3次，取其平均值，每24 h測(cè)定1次，清除率按下式計(jì)算：DPPH·自由基清除率（%）=[1-（Ai-Aj）/A0]×100。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2007統(tǒng)計(jì)分析所有數(shù)據(jù)，計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)誤差并制圖；應(yīng)用SPSS11.5軟件對(duì)數(shù)據(jù)差異顯著性進(jìn)行分析，P<0.05表示差異顯著。完成果皮油胞病害發(fā)生率與精油氧化還原性的相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 臍橙果皮精油處理后對(duì)臍橙果皮油胞病害發(fā)生率的影響

由圖1可知，臍橙果實(shí)經(jīng)果皮精油不同方法處理后，直接涂抹精油的果實(shí)發(fā)生油胞下陷病害的比例顯著大于其他處理的臍橙果實(shí)，貯藏的臍橙果皮油胞下陷指數(shù)隨貯藏時(shí)間而緩慢增加。直接涂抹精油的臍橙在后期貯藏時(shí)（至56 d）果皮油胞下陷指數(shù)增加到接近4.00，高于其他方式處理的貯藏果實(shí)（P<0.05），而其他方式處理的則分別為3.61、3.35和3.06。另外，用維生素C處理過(guò)后涂抹精油的臍橙與未涂抹精油的臍橙在前14 d發(fā)生油胞下陷的指數(shù)非常接近（至14 d時(shí)分別為1.76和1.68），并無(wú)顯著差異（P>0.05），但從第21天開始出現(xiàn)差別，此時(shí)維生素C慢慢失去抗氧化作用，往后逐漸加重，至第8周時(shí)，維生素C處理過(guò)的果皮油胞下陷指數(shù)增加到3.35，4者之間顯著性差異（P<0.05），但相較于處理方式1與2，用維生素C處理過(guò)涂抹精油后的臍橙發(fā)生油胞下陷的時(shí)間及程度均都有所降低，說(shuō)明維生素C的抗氧化作用處理能降低油胞下陷的發(fā)生。

2.2 臍橙果皮精油pH 變化情況

由表2可知，通過(guò)對(duì)精油pH值的測(cè)定，發(fā)現(xiàn)隨著貯藏時(shí)期的延長(zhǎng)，pH值在緩慢的逐漸增大，在第49天時(shí)，2者的pH值分別達(dá)到了6.12和6.34，2者的pH值變化在貯藏期間并無(wú)顯著差異（P>0.05）。而2種精油的顏色隨著貯藏時(shí)間的增加也在逐步的加深，至第49天時(shí)分別變?yōu)樽攸S色和棕色，癥狀果精油的顏色更深，且隨著時(shí)間的增加，其pH值仍在不斷增加。

2.3 臍橙果皮精油活性氧產(chǎn)生速率的變化

由圖2可知，癥狀果和正常果采后貯藏期間活性氧產(chǎn)生速率均有一高峰，之后逐漸呈下降趨勢(shì)。剛開始幾周活性氧產(chǎn)生速率較快，癥狀果在第28天活性氧產(chǎn)生速率達(dá)到了0.93 μmol·g-1·min-1，比正常果升高了4.5%，而正常果產(chǎn)生活性氧速率上升緩慢，至第35天時(shí)，活性氧產(chǎn)生速率為0.89 μmol·g-1·min-1。在前28 d，癥狀果產(chǎn)生活性氧速率明顯高于正常果，且呈上升趨勢(shì)，從第35天開始，活性氧產(chǎn)生速率逐漸下降，并且2者差異不顯著（P>0.05）。在整個(gè)貯藏期間，2種果皮精油活性氧產(chǎn)生速率無(wú)顯著性差異（P>0.05）。

2.4 臍橙果皮精油維生素C含量變化

由圖3可知，果皮精油中維生素C含量非常低，且隨時(shí)間增加而逐漸降低，貯藏期間正常臍橙果皮精油維生素C含量顯著高于癥狀果皮精油維生素C 含量（P<0.05），2種果實(shí)在貯藏過(guò)程中，果皮精油維生素C含量在不斷的下降，正常臍橙果皮精油在貯藏前的維生素C含量為23.4 mg·L-1，比癥狀臍橙果皮精油在貯藏前的維生素C含量高10.38%，臍橙果實(shí)在貯藏49 d后，果皮精油維生素C含量急劇下降，分別下降了82.05%，83.96%。隨著時(shí)間的增加，仍然有繼續(xù)下降的趨勢(shì)。

2.5 臍橙果皮精油的抗氧化活性

結(jié)果表明，2種臍橙果皮精油對(duì)DPPH自由基有一定的清除能力，正常果皮精油清除DPPH能力顯著高于癥狀果（P<0.01），2者的清除率在第7天時(shí)分別為74.39%和68.46%，表明其具有一定的抗氧化活性；且正常臍橙果皮精油的抗氧化活性明顯高于發(fā)生癥狀的（P<0.05）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果同時(shí)發(fā)現(xiàn)，橘皮精油的抗氧化活性表現(xiàn)出隨著放置時(shí)間的增加而逐漸下降，放置21 d后，其對(duì)DPPH·的清除率分別下降了8.8%和15.8%，隨著精油存放時(shí)間的延長(zhǎng)，其抗氧化能力還在不斷的下降（圖4）。

3 討 論

臍橙果實(shí)經(jīng)果皮精油處理后，油胞下陷發(fā)生率明顯增加，說(shuō)明精油可誘導(dǎo)臍橙油胞下陷病害的發(fā)生。分析認(rèn)為果皮精油誘導(dǎo)后，引起了果皮細(xì)胞代謝紊亂，造成了果皮組織的膜脂過(guò)氧化和脫酯化作用[16-18]，致使病害發(fā)生。分析認(rèn)為，由于臍橙精油暴露在空氣中極易被氧化，在精油的氧化過(guò)程中對(duì)果皮油胞造成了不同程度的傷害，從而誘導(dǎo)了油胞下陷的發(fā)生。臍橙果皮精油氧化還原性會(huì)導(dǎo)致果實(shí)油胞下陷病發(fā)生，精油活性氧產(chǎn)生速率及抗氧化活性的變化為這一機(jī)理提供了依據(jù)。但對(duì)于橘油誘導(dǎo)油胞下陷病的機(jī)制還需要進(jìn)一步研究。

臍橙果實(shí)采后在貯藏過(guò)程中正常果和油胞果的油胞病害發(fā)生率與活性氧、維生素C含量等都密切相關(guān)。正常果皮精油維生素C含量、抗氧化活性明顯高于癥狀果；果皮油胞下陷病害的程度隨著活性氧的增加而逐漸的加重。因機(jī)體在正常的生命過(guò)程中伴有活性氧自由基的產(chǎn)生，根據(jù)活性氧自由基傷害學(xué)說(shuō)，在正常生理?xiàng)l件下，植物體內(nèi)產(chǎn)生的活性氧不足可使植物受到傷害，如果活性氧的產(chǎn)生加快，而清除系統(tǒng)的功能降低，就會(huì)使活性氧在體內(nèi)積累。隨著時(shí)間的變化，果實(shí)體內(nèi)氧化代謝發(fā)生變化，果實(shí)的抗病能力改變，導(dǎo)致病變發(fā)生。此外，這可能與氧化性爆發(fā)（oxidative burst）有關(guān)，即果皮組織或細(xì)胞在受到病菌或誘病因子的誘導(dǎo)下能在一定的時(shí)間內(nèi)產(chǎn)生大量的活性氧物質(zhì)，使細(xì)胞中活性氧的水平比正常高2～5倍，這些活性氧具有強(qiáng)氧化性，使果皮受到傷害，從而更易發(fā)生病變。

橘皮精油具有一定的抗氧化能力，但隨著精油存放時(shí)間的延長(zhǎng)，其抗氧化能力有下降的趨勢(shì)。而由果皮提取的臍橙精油經(jīng)科學(xué)鑒定主要含有D-檸檬烯，它在植物抗氧化中起關(guān)鍵作用。然而D-檸檬烯是一種不穩(wěn)定的有機(jī)物，在光照和水分的影響下，它能自動(dòng)氧化成香芹酮、香芹醇及一系列雜質(zhì)，從而慢慢失去了抗氧化的作用。本研究結(jié)果表明，果皮精油的氧化破壞是導(dǎo)致臍橙發(fā)生油胞下陷的重要原因之一。因而，在本實(shí)驗(yàn)條件下控制精油的氧化破壞，可以顯著降低臍橙果實(shí)油胞下陷的發(fā)生。

4 結(jié) 論

臍橙果皮精油對(duì)臍橙果實(shí)油胞下陷發(fā)生率及發(fā)生程度均有顯著影響，同時(shí)果皮精油具有一定的抗氧化能力，且其抗氧化性活性隨放置時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸降低，精油的氧化還原性對(duì)油胞下陷的發(fā)生產(chǎn)生影響。同時(shí)正常果與癥狀果精油的維生素C含量、活性氧產(chǎn)生速率呈顯著性差異。也證實(shí)了果皮精油的抗氧化性影響著油胞下陷的發(fā)生。

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