曹尚銀 沈程清 曹達 薛華柏 謝深喜 李好先

摘 要： 【目的】為了探明鹽脅迫下棗蛋白表達的差異，【方法】以較耐鹽堿的‘七月鮮棗品種的扦插苗為材料，經過臨界濃度（0.60%）的鈉鹽（NaCl）處理，取其葉片進行蛋白質雙向電泳，經ImageMaster 2D分析，【結果】結果表明，處理與對照之間總蛋白的整體分布模式非常相似，在pH 3～10和MW50～90 kD內的蛋白點分布最多，處理與對照之間量變倍數(shù)大于1.5倍的差異點有26個，其中6個蛋白受脅迫上調， 20個蛋白受脅迫下調。在上調的蛋白質點中，3個點受鹽脅迫誘導增加了近4倍，2個蛋白質點相對豐度增加了2倍以上，表現(xiàn)出強烈的鹽誘導特性。說明他們可能在棗的抗鹽機制中發(fā)揮重要作用。在下調的蛋白質點中，2個點相對豐度降低至對照的5倍左右，表現(xiàn)出強烈的鹽抑制特性，說明其可能是對鹽脅迫比較敏感的2個蛋白質或多肽，并且在棗的抗鹽性機制中也發(fā)揮比較重要的作用?！窘Y論】在臨界濃度鈉鹽脅迫下，棗葉片蛋白質表達有顯著差異。

關鍵詞： 棗； 鹽脅迫； 蛋白質； 雙向凝膠電泳

中圖分類號：S665.1 文獻標志碼：A 文章編號：1009-9980？穴2013？雪01-0043-05

土壤鹽漬化已經成為制約世界農業(yè)發(fā)展的重要因素，鹽脅迫是影響植物生長、降低作物產量的重要因素。隨著溫室效應引起的全球氣候變暖，使得部分地區(qū)環(huán)境持續(xù)惡化，預計到2050年全球將有超過50%的耕地會變得鹽堿化[1-2]。探索植物耐鹽機制，提高植物耐鹽性，開展耐鹽作物分子育種已成為一種有效的應對措施[3]，這對減輕人類所面臨的土地資源和淡水資源短缺、糧食供需矛盾以及有效控制環(huán)境惡化都有著重要的戰(zhàn)略意義。

棗原產我國，已有7700余年的栽培歷史，較抗鹽堿、耐旱、耐瘠薄。棗果實營養(yǎng)豐富，含糖量居各類果品之首，維生素C的含量高于柑橘10倍，高于蘋果80倍，是梨的100倍。棗是我國優(yōu)勢果品，國外有30多個國家先后引種了我國的棗，但除韓國外均尚未形成規(guī)模化商品栽培，迄今98%的棗資源和100%的棗產品國際貿易集中在我國。目前我國的主要棗區(qū)大多是在過去不適宜耕作的山、沙、堿地區(qū)建立發(fā)展起來的。在河北、山東環(huán)渤金絲小棗產區(qū)和河南內黃扁核酸棗區(qū)歷史上是著名的鹽堿區(qū)，形成上千公頃的棗林帶或林區(qū)，但產量較低，品質較差。近年來，我國的新疆和沿海地區(qū)，在鹽堿地正探索大面積發(fā)展棗樹生產。如何提高棗樹的耐鹽性已成為我們亟待研究的重大問題[4]。這不僅關系到提供棗產量和品質，更關系到國內外棗產品的供應，我國民族果樹的振興，關系到數(shù)百萬棗農的小康生活，關系到鹽堿地的綜合治理與開發(fā)。

當前，關于棗樹耐鹽性的研究主要集中于生態(tài)學和生理生化特性研究[4]，而其耐鹽性相關分子生物學研究，尤其是蛋白組學研究幾乎無人涉及。研究嘗試并確定了抗鹽性較強的‘七月鮮棗葉片雙向電泳體系，通過高通量的蛋白組學方法[5-6] ，分析棗耐鹽脅迫反應相關蛋白，為進一步研究鹽脅迫下棗葉片特異蛋白質的功能及揭示棗耐鹽分子機制奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 材料

試驗在中國農業(yè)科學院鄭州果樹研究所棗良種圃進行，試驗材料為‘七月鮮棗當年生扦插苗。扦插苗屬于同一母樹上發(fā)育良好、無病蟲害及機械損傷的半木質化枝條快繁而成。盆栽基質為良種圃中普通土加草炭100 g·kg-1（干質量，下同）和河沙50 g·kg-1，混勻、過篩。盆土基質含有機質0.98%、速效氮（N）0.0067%，速效磷（P）0.0033%，速效鉀（K）0.0115%，pH 7.12，含鹽量0.026%。栽植用塑料（PVC）盆，高33 cm，上口徑40 cm，下口徑33 cm，底部有排水孔，置于托盤上。每盆裝基質7.12 kg（干質量）。2009年3月12日每盆栽大小基本一致的3株棗苗， 每個處理3次重復，每個重復10盆，NaCl處理濃度為： 0， 0.60%（依文獻[4]試驗結果設計的超臨界濃度（0.60%）的鈉鹽，按基質干質量計），取相應量NaCl加水至1 500 mL，一次澆入，自然光照避雨狀態(tài)下培養(yǎng)，每5 d根據土壤濕度補充等量自來水，有溶液滲出到托盤中，于2 h后返澆盆中。第25天分別采集每株苗木中部3枚成熟葉片用ddH2O沖洗干凈后迅速用濾紙輕輕擦干，稱質量。

1.2 蛋白質的提取與定量

棗總蛋白的提取方法參照本實驗室朱志勇等[7] 已經建立的蘋果蛋白質提取的方法，略有改動。切取棗葉組織，切碎成3 mm×3 mm的小塊，在液氮中，用研缽磨碎成細粉狀。將組織細粉轉入50 mL離心管中，加入25 mL TCA/丙酮（1∶9），65 mmol·L-1 DTT，-20 ℃沉淀1 h。離心10 000 r·min-1，45 min，去除上清，沉淀加入25 mL純丙酮，-20 ℃沉淀1 h，離心10 000 r·min-1，45 min，去除上清，空氣干燥，-80 ℃保存。

稱取500 mg棗葉組織，加入0.5 mL全細胞裂解液（7 mol·L-1尿素，2 mol·L-1硫脲，65 mmol·L-1 Tris ，4% CHAPS，0.2%IPGbuffer），混均，超聲破碎細胞（冰?。ｋx心12 000 g，45 min，取上清，上清用0.22 μm過濾，獲得澄清溶液。上清采用Bradford法定量，100 μg分裝樣品，-80 ℃保存。

1.3 棗葉部蛋白質雙向電泳及凝膠檢測

雙向電泳根據Bio-Rad公司的ProteomeWorksTMSystem中的方法進行。樣品制備后，用水化上樣緩沖液將樣品濃度稀釋為1 g·L-1，用于雙向電泳上樣。第1向等電聚焦采用pH 3～10，17 cm非線性的IPG預制膠條，對處理樣品分別取約含150 μg總蛋白的300 μL水化液，以主動水化上樣的方式上樣。等電聚焦程序設置為50 V， 14 h；250 V， 1 h；500 V， 1 h；1 000 V， 1 h；1 000～10 000 V線性上升5 h，10 000 V， 65 kVh；等電聚焦溫度為20 ℃。聚焦完畢后采用兩步平衡法，每步15 min。第2向電泳采用12% SDS-PAGE，在17℃循環(huán)水浴冷卻下進行。雙向電泳凝膠染色采用改良的銀染法[5]。

1.4 雙向電泳凝膠圖譜分析

雙向電泳凝膠圖象掃描采用GS800光密度掃描儀（Bio-Rad），用PDQuest8.0版軟件進行圖像分析，斑點檢測和匹配分析，找出差異蛋白。

1.5 作蛋白質強度柱狀圖方法

以不同膠為x 軸，不同膠中某一個差異點的定量值信息為Y軸；以灰色豎線分割兩個組；藍色橫線表示該組內蛋白的集中趨勢；紅色橫線表示該組內蛋白的離散度； a、 b、c分別代表對照的統(tǒng)計學dispersion 極值；而a、b、 c矩形條代表對照蛋白點統(tǒng)計學定量在該范圍內變化（即離散區(qū)間）。d、e、f 分別代表處理的統(tǒng)計學dispersion極值；而d、e、f矩形條代表處理蛋白點統(tǒng)計學定量在該范圍內變化（即離散區(qū)間）。作蛋白質強度柱狀圖。

2 結果與分析

2.1 棗葉片可溶性蛋白質提取率

配置考馬斯亮藍G-250蛋白質顯色液，以標準蛋白質BSA作蛋白質濃度與OD值之間標準曲線。為了增加標準曲線的可靠性，不同濃度BSA標準品的光吸收值均設3次重復，pH調節(jié)到7.4（圖1）。

抽提蛋白中，蛋白質提取率的高低是檢驗提取方法優(yōu)劣的主要指標之一。本研究采用Bradford法對蛋白進行定量，用牛血清白蛋白（BSA）制作標準曲線，蛋白濃度在0～100 g·L-1內，R2=0.997 7。采用TCA丙酮沉淀法提取蛋白質，在λ=595 nm時，檢測出棗葉片中蛋白平均濃度為11 g·L-1，其濃度較高，表明此蛋白提取方法較可靠，且為后續(xù)雙向電泳圖譜的清晰度、重復性奠定了基礎。此外，提高樣品中的蛋白濃度從而增加重泡漲液（水化緩沖液）的用量，能夠使樣品得到充分泡漲，第1向電泳的聚焦效果好，電壓能上升到8 000 V，但樣品蛋白濃度也不能過高，以不析出結晶為宜，否則亦會影響等電聚焦效果。

利用雙向電泳技術對‘七月鮮棗葉片的蛋白進行分離，為保證試驗的重復性，在相同條件下對2組樣品分別進行了3次重復性試驗（a、b、c為對照、d、e、f為0.6%NaCl處理過的‘七月鮮棗）。蛋白質濃度均為11 g·L-1，其總蛋白的整體分布模式非常相似： 在pH 3～10和MW50～90 kD內的蛋白點分布最多。其中檢測到a蛋白質點為： 2 642個；b蛋白質點為： 2 386個；c蛋白質點為： 2 835個；d蛋白質點為： 2 333個；e蛋白質點為： 2 210個；f蛋白質點為： 2 576個。銀染后獲得的原始二維凝膠圖譜結果如圖2。

2.2 氯化鈉脅迫下棗葉片蛋白質雙向電泳分析

經掃描儀采集圖像后，用Image Master 2D圖像處理軟件進行了背景消除、污染點去除和放大檢測，共檢測出棗在鹽脅迫下26個蛋白質點發(fā)生了變化，其中6個上調蛋白、20個下調蛋白（圖3）。

用蛋白質強度柱狀圖信息顯示兩組樣品之間量變倍數(shù)大于1.5 倍差異點，26個受鹽脅迫影響而變化明顯的蛋白質點中，6個受脅迫上調，上調蛋白分別是1 717、1 253、1 459、1 233、2 120、2 474；20個受脅迫下調，下調蛋白分別是2 443、2 496、2 498、287、2 543、2 288、2 550、1 896、1 418、1 527、1 526、1 374、1 362、1 438、 6 811、655、1 528、1 182、647、492。在上調的蛋白質點中（圖4），1 459、2 474、1 233變化最大，與對照相比，受鹽脅迫誘導增加了4倍以上；其次是1 253和2 120 ，這2個蛋白質點在鹽脅迫后相對豐度增加了2倍以上，表現(xiàn)出強烈的鹽誘導特性，說明他們可能在棗的抗鹽機制中發(fā)揮重要作用。在下調的蛋白質點中，2 543、2 498受鹽脅迫抑制（圖4）最大，其相對豐度降低至不到對照的五分之一，表現(xiàn)出強烈的鹽抑制特性，說明2 543、2 498可能是對鹽脅迫比較敏感的2個蛋白質或多肽，并且在棗的抗鹽性機制中也發(fā)揮比較重要的作用；其他受鹽脅迫抑制而相對豐度降低比較大（3倍以上）的蛋白質點還有647、1 527、287、492（圖版）。

3 討 論

差異蛋白質組學研究是目前蛋白質組學研究的熱點之一。通過尋找某種特定因素所引起的細胞或組織的蛋白質組變化，并對某些標志性蛋白進行定性和功能分析，揭示這些差異蛋白與特定生理、病理過程的相關性，從而探察細胞或機體對環(huán)境刺激的反應及細胞調控的機制。通過獲取的蛋白質樣品的表達譜信息來進行差異蛋白質組研究為細胞信號調節(jié)、代謝途徑、增殖分化等基礎性生命科學研究提供了一個有效工具。生命科學研究已經從基因組時代走入到了蛋白質組時代，雖然，植物蛋白質組學研究要明顯落后于醫(yī)學相關的蛋白質組學研究的進程，但是，隨著植物基因組和表達序列標簽（EST）數(shù)據庫的不斷發(fā)展，借助人類和動物模型研究獲得的方法，植物蛋白質組學也越來越受到關注，并取得了一定的研究成果。紅海欖 （Rhizophora stylosa ）是一種典型的紅樹林鹽生植物。 范吉星等[8]研究利用差異蛋白組學技術對淡栽（R0）和 30 g·kg-1氯化鈉鹽栽（R3）處理后的紅海欖根部總蛋白進行了比較研究。 結果表明，在鹽水栽培上調的蛋白質一般與逆境脅迫有關， 淡水栽培上調的蛋白質一般與基本代謝有關。 這些研究結果為進一步研究紅海欖的耐鹽機制提供了有意義的線索。在高鹽脅迫下葡萄芽尖中 191 種蛋白質表達豐度發(fā)生變化， 其中約 44%為具有同工型的蛋白質， 且參與光合作用、 蛋白質合成和定位的蛋白質的表達豐度明顯下調[9]。1997年，Ramani等[10]。以水稻幼苗葉片為材料，利用體內標記結合雙向電泳和放射性同位素自顯影技術，共檢測到52個蛋白質與鹽脅迫有應答關系。其中35個被鹽脅迫誘導，17個被鹽脅迫抑制，包括20個在這之前未曾報道的低豐度蛋白。這些發(fā)現(xiàn)對尋找鹽壓應答新基因，尤其是那些在水稻鹽耐性獲得中起瞬時調節(jié)作用的基因十分重要。在本實驗中，以0.60%的鈉鹽（NaCl）處理‘七月鮮棗，結果表明，處理與對照之間蛋白質量變倍數(shù)大于1.5倍的差異點有26個，其中6個蛋白受脅迫上調， 20個蛋白受脅迫下調。在上調的蛋白質點中，3個點受鹽脅迫誘導增加了近4倍，2個蛋白質點相對豐度增加了2倍以上，表現(xiàn)出強烈的鹽誘導特性，說明他們可能在棗的抗鹽機制中發(fā)揮重要作用。在下調的蛋白質點中，2個點相對豐度降低至對照的5倍左右，表現(xiàn)出強烈的鹽抑制特性，說明其可能在棗的抗鹽性機制中發(fā)揮了比較重要的作用。關于鈉鹽脅迫后棗葉片中發(fā)生顯著變化的26個蛋白質點的具體生物學功能還有待于質譜鑒定以及進一步的、系統(tǒng)的功能解析研究。（本文圖版見封3）

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