馬延娜， 薛 靜， 徐搖光， 張曉東*

1.首都師范大學生命科學院，北京100037；

2.北京市農林科學院北京農業(yè)生物技術研究中心，北京100097

植物化學誘導基因表達系統(tǒng)研究進展

馬延娜1，2， 薛 靜2， 徐搖光2， 張曉東2*

1.首都師范大學生命科學院，北京100037；

2.北京市農林科學院北京農業(yè)生物技術研究中心，北京100097

隨著植物基因工程的發(fā)展，植物的化學誘導表達系統(tǒng)受到越來越多的重視?；瘜W誘導表達系統(tǒng)通常包含兩個元件，第一個元件多為一個嵌合的轉錄因子，可以特異性的結合到啟動子上；第二個元件具有前面的轉錄因子的結合位點，從而控制目的基因的表達。本文綜述了當前廣泛應用的一元誘導基因表達系統(tǒng)，如四環(huán)素誘導表達系統(tǒng)，和二元誘導表達系統(tǒng)，包括：乙醇誘導、地塞米松誘導、β2雌激素誘導和熱休克誘導等不同系統(tǒng)，總結了各化學誘導表達系統(tǒng)的最新研究進展及其潛在利用的可行性。

化學誘導；激活子；效應因子；一元基因盒；二元基因盒

目前大規(guī)模商業(yè)化的轉基因產(chǎn)品中廣泛應用的啟動子多是組成型啟動子，例如雙子葉植物中常用的來自花椰菜花葉病毒（CaMV）的35S啟動子和來自農桿菌的胭脂堿合酶（Nos）啟動子，單子葉植物中經(jīng)常應用的水稻肌動蛋白-1（Rac1）啟動子以及玉米泛素-1（Ubi-1）啟動子等［1～3］。

隨著植物基因工程的發(fā)展，用特異性啟動子取代組成型啟動子，對外源基因的表達進行精確調控，使其在植物體內適時、適量地表達，顯得尤為重要。組織特異性啟動子調控基因只在某些特定組織或器官中轉錄，對于闡明植物生長發(fā)育、代謝途徑等非常重要，具有很好的應用前景。與組織特異性啟動子相比，誘導型啟動子有著獨特的優(yōu)點，可根據(jù)需要，在植物的特定發(fā)育階段、特異的組織器官或特定生長環(huán)境下，施加誘導信號，誘導目的基因的表達；也可解除脅迫，讓目的基因的表達停止。這種快速、定點誘導外源基因轉錄的“開”與“關”，可真正實現(xiàn)外源基因的精確調控。在各類誘導型啟動子中，化學誘導系統(tǒng)由于可控性強，應用最為廣泛。

化學誘導表達系統(tǒng)通常包含兩個元件，第一個元件多為一個嵌合的轉錄因子，可以特異性的結合到某些基因的啟動子上。這個嵌合的轉錄因子只有在受到誘導后才能激活下游啟動子的轉錄，通常稱之為激活子；第二個元件具有前面的轉錄因子的結合位點，通常稱這個元件為效應因子。效應因子的兩端通常會有一個組成型表達的mini35S啟動子，從而能夠保證一個最基本的轉錄機制，但是要通過內源的轉錄激活子將它的激活活性降到最低。激活子和效應因子可以同時在一個基因盒中，為一元的基因盒表達系統(tǒng)；也可以分別位于不同的載體上，為多元基因盒表達系統(tǒng)，應用較多的多為二元基因盒誘導表達系統(tǒng)［4］。

通過化學誘導表達系統(tǒng)可以實現(xiàn)對目標基因轉錄的去阻遏、失活和激活。對目標基因轉錄的去阻遏系統(tǒng)研究和應用較多的主要是基于四環(huán)素受體的去阻遏誘導系統(tǒng)，基于四環(huán)素受體還構建有失活基因表達系統(tǒng)。基于目標基因轉錄激活的誘導表達系統(tǒng)在植物中研究最多，也應用最為廣泛，包括：基于糖皮質激素受體的可誘導基因表達系統(tǒng)、基于糖皮質激素受體和四環(huán)素抑制因子的雙向誘導基因表達系統(tǒng)、基于雌激素受體的甾類激素誘導的表達系統(tǒng)和基于蛻皮激素受體的殺蟲劑誘導表達系統(tǒng)等。這些誘導表達系統(tǒng)的原理及應用在前人的研究中已得到詳細的介紹［5～7］。本文主要討論植物化學誘導表達系統(tǒng)的最新研究進展及其潛在利用的可行性。

1 一元誘導表達系統(tǒng)

目前四環(huán)素被廣泛用于人工構建的基因誘導表達系統(tǒng)。該系統(tǒng)通過四環(huán)素結合到四環(huán)素受體上來調控目標基因的轉錄。由于四環(huán)素的誘導效率依賴于四環(huán)素受體的濃度，且高濃度的四環(huán)素對所誘導的植物是有害的，而植物中四環(huán)素受體濃度有限，使得四環(huán)素誘導表達系統(tǒng)的應用也受到極大的限制，因此發(fā)展新的四環(huán)素衍生物對于提高基于四環(huán)素受體的誘導表達系統(tǒng)的應用范圍具有重大意義。目前，對四環(huán)素衍生物的研究越來越受到重視，并已經(jīng)開發(fā)出上千種四環(huán)素衍生物，但是其中只有少數(shù)可以被利用［8］。Aleksan

drov等［9］利用熒光實驗和自由能分子動力學模擬實驗分別對四環(huán)素及15種四環(huán)素衍生物與四環(huán)素受體的結合特異性進行了研究，研究發(fā)現(xiàn)在某些位點具有疏水基團的四環(huán)素衍生物能夠促進其結合到四環(huán)素受體上。4-二甲氨基類的四環(huán)素衍生物相比于含疏水基團的四環(huán)素衍生物具有更強的促進作用，能夠極大地提高同四環(huán)素受體的結合效率，從而在較低濃度條件下就能達到較好的誘導效果。

別構效應在化學誘導表達系統(tǒng)中發(fā)揮著關鍵的作用，如在基于四環(huán)素受體的誘導系統(tǒng)中，在無誘導劑時四環(huán)素受體為一種構象，在誘導劑出現(xiàn)后通過變構效應，轉變成為可與DNA結合的構象［10］。在四環(huán)素的替代物的研究方面，除了構建新的四環(huán)素衍生物之外，Goeke等［11］發(fā)現(xiàn)一些短鏈的活性肽也可以作為四環(huán)素受體的誘導劑、反誘導劑或者輔阻遏物。這些活性肽可以持續(xù)地結合在四環(huán)素受體的四環(huán)素結合位點，顯著地引發(fā)四環(huán)素受體的別構行為繼而引起誘導、失活或者阻遏效應。更進一步的研究發(fā)現(xiàn)誘導基因表達和誘導基因失活的活性肽是分別結合在四環(huán)素受體的不同位置，分別進行各自的調控反應。誘導表達系統(tǒng)的工作原理主要是基于蛋白質與蛋白質之間的相互作用，因此這些活性肽的發(fā)現(xiàn)無疑對蛋白質介導的基因表達調控系統(tǒng)產(chǎn)生重大的影響，對于我們更加深入的研究和應用化學誘導表達系統(tǒng)具有深遠的意義。

2 二元誘導表達系統(tǒng)

大多數(shù)誘導表達系統(tǒng)為單一的盒式系統(tǒng)，雖然這些系統(tǒng)已經(jīng)在一定程度上加快了轉化過程，但是二元誘導表達系統(tǒng)為載體整合到植物基因組中后進一步驗證系統(tǒng)的功能提供了可能。二元誘導系統(tǒng)可以通過優(yōu)化選擇不同功能激活子和效應因子的組合而避免不希望出現(xiàn)的副作用。這些組合通過相互交換組合，從而獲得一個完全的誘導表達系統(tǒng)。此外，二元誘導表達系統(tǒng)能夠通過不同的激活子和效應因子組合來確保多種功能的實現(xiàn)，通過不同的組合易于篩選出只限于特定組織或者可以耐受多重效應因子的誘導表達組合。

2.1 乙醇誘導的基于AlcR／AlcA的基因表達系統(tǒng)

AlcR轉錄因子（激活子）和AlcA啟動子（啟動目的基因表達）是從Aspergillus nidulans中分離出來的［12～14］。在這個系統(tǒng)中AlcR轉錄因子受乙醛誘導激活，乙醛是植物中的乙醇代謝途徑中產(chǎn)生的。在擬南芥中AlcA啟動子不能被內源的轉錄因子激活，即使是在厭氧條件下也不能夠激活［13］。在這個系統(tǒng)中，激活子和啟動子分別位于兩個不同的植物轉化載體上。這個系統(tǒng)非常適合利用脈沖進行誘導或者進行局部誘導，因為利用特異的啟動子和乙醇快速蒸發(fā)的性質可以對AlcR的表達進行精確的調控，使其以精確的模式發(fā)揮作用［15，16］。但是由于乙醇對植物的毒性作用，脈沖誘導必須進行仔細校準以確保在最短的時間內達到最大的誘導效應。

2.2 地塞米松誘導的基于融合糖皮質激素受體、GVG／UAS或者pOp／LhGR誘導表達系統(tǒng)

這三種誘導表達系統(tǒng)都是基于糖皮質激素受體（GR）的配體結合域的反應特性而構建的［17］。該結構域含有93個氨基酸，在沒有甾類激素存在時，GR同細胞質基質中的熱休克蛋白HSP90相互作用，而轉錄因子與GR的結合是沒有激活活性的，由于它們同HSP90結合錨定在細胞質中，因此不能進入到細胞核中［18］。但是在經(jīng)過人工合成的甾類激素地塞米松的處理后，GR-HSP90之間的相互作用就被中斷，釋放出HSP90，從而使GR-轉錄因子復合體可以進入細胞核。在細胞核中，轉錄因子結合并激活目的基因的表達。該系統(tǒng)的優(yōu)越性在于糖皮質激素受體結構域可以直接與目標轉錄因子結合［19，20］。

如果目標基因不是轉錄因子，還可以利用含有GR結構域的融合轉錄因子進行誘導，GVG／UAS就屬于這類誘導表達系統(tǒng)。GVG激活子含有一個酵母菌Gal4 DNA結合結構域、來自皰疹病毒的強轉錄激活子VP16和GR受體［21］。目的基因的復制受到位于上游的一個激活序列（UAS）的調控。該系統(tǒng)現(xiàn)已成功應用，但是誘導產(chǎn)物需要小心謹慎地進行處理，在擬南芥和若干其他植物的應用研究中發(fā)現(xiàn)，高表達水平的GVG會導致嚴重的生長發(fā)育缺陷甚至死亡［22～28］。

另一種基于糖皮質激素受體的二元誘導表達系統(tǒng)pOp／LhGR的激活子LhGR包括一個同大腸桿菌lac受體具有較高親緣性的突變體，這個突變體同酵母菌的Gal4轉錄激活結構域融合，并同GR結合［29］。目的基因可以通過下6個拷貝數(shù)的lac操作子進行復制。這個系統(tǒng)相較于前兩個系統(tǒng)有著獨特的優(yōu)勢，它既可以利用一元基因盒模式也可以通過二元模式高效、快速地進行誘導表達，到目前為止的報道中均未發(fā)現(xiàn)副作用，該系統(tǒng)通過優(yōu)化已成功應用于煙草中［30～33］。

2.3 β2雌激素誘導的XVE／OlexA基因表達系統(tǒng)

XVE激活子含有一個lexA受體結構域，這個結構域同VP16轉錄激活結構域和人雌激素受體ER融合［34］。當向系統(tǒng)提供雌激素如17β-雌二醇時，XVE激活子結合到8個拷貝數(shù)的lexA結構域上，進而激活下游目的基因的轉錄。研究發(fā)現(xiàn)，在擬南芥中植物雌激素不能激活該系統(tǒng)，但是相關報道指出在大豆的種子中高濃度的植物雌激素可以使這個系統(tǒng)非特異性的激活［35］。但是對于外源的雌激素如β-雌二醇，在高達25μmol／L的濃度條件下既不會對擬南芥的生長發(fā)育過程產(chǎn)生影響，也不會對內源基因的表達產(chǎn)生影響［36］。因此這就大大擴展了這個誘導表達系統(tǒng)的使用范圍。

2.4 熱休克誘導表達系統(tǒng)

來自于擬南芥的熱休克蛋白18.2（HSP18.2）基因［37］的啟動子在某些植物中已經(jīng)被成功用于在熱休克之后誘導相關基因的表達［38～40］。在沒有熱休克處理時，HSP18.2的啟動子是處于抑制狀態(tài)的［41］。轉基因植株在經(jīng)過37℃的熱休克處理后，通過反向激活啟動下游目的基因的轉錄復制。

3 總結與展望

近年來關于化學誘導表達系統(tǒng)的應用研究非常廣泛，根據(jù)各類誘導表達系統(tǒng)的作用機理將其簡單分為一元誘導表達系統(tǒng)和二元誘導表達系統(tǒng)兩大類。每種類型的誘導表達系統(tǒng)都各有其優(yōu)點和不足，必須根據(jù)所要誘導的目的基因及研究植物種類的不同選擇合適的誘導表達系統(tǒng)，并通過優(yōu)化各種反應條件，從而達到預期的實驗效果。

化學可誘導表達系統(tǒng)可以實現(xiàn)精確控制外源基因的表達，因此在基因工程應用之中具有優(yōu)勢，國內外研究者也對此進行了不斷的研究，針對已有的成熟的誘導系統(tǒng)進行改造，或開發(fā)新的誘導表達系統(tǒng)。無論是一元誘導表達系統(tǒng)還是二元誘導表達系統(tǒng)，都可以通過進一步改造配體結構域，使用不同的激活劑、優(yōu)化DNA結合結構域，優(yōu)化使用最小的啟動子及啟動子應答元件序列等手段，最終達到降低背景表達量，提高誘導表達效率的目的。

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The Development of Chem ical Induced Gene Expression System in Plants

Ma Yan-na1，2，XUE Jing2，Xu Yao-guang2，ZHANG Xiao-dong2*
1.Collage of Life Science，Capital Normal University，Beijing 100037，China；
2.Beijing Agricultural Biotechnology Research Center，Beijing Academy of Agriculture and Forestry Science，Beijing 100097，China

With the development of plantgenetic engineering，the application of plant chemical induced gene expression system is becomingmore and more important.Chemical induced gene expression system typically consists of two components，the first component is mostly a chimeric transcription factor which can specific bind to the promoter.The second element has a transcription factor binding site for the first element，and thereby controlling the expression of target genes.Here，we review the currentwidely used one component inducible gene expression system，such as the tetracycline inducible expression system，and two components inducible expression systems，including：ethanol-induced，dexamethasone-induced，β2 estrogen hormoneinduced and heat shock-induced systems.This papermainly discusses the recent progress on chemical inducing gene expression systems and their potential use in plants.

chemical induction；activator；effector；single gene cassette；binary gene cassette

10.3969／j.issn.2095-2341.2013.01.09

2012-11-01；接受日期：2012-12-25

馬延娜，碩士研究生，研究方向為分子遺傳學。*通訊作者：張曉東，研究員，博士，主要從事作物遺傳育種研究。E-mail：zhangxiaodong＠baafs.net.cn