何漸鳴 王明慧 毛鈺霞 沈衛(wèi)德，3 許雅香，3*

(1蘇州大學基礎醫(yī)學與生物科學學院，江蘇 蘇州 215123;2現(xiàn)代絲綢國家工程實驗室;3蘇州大學蠶桑研究所)

RNAi是由雙鏈RNA引發(fā)的序列特異性基因沉默現(xiàn)象［1］，可高效、特異地沉默特定基因。這是個應對病毒感染或dsRNA結構分子進化保守的防御應答機制，除RNAi外，病毒或dsRNA也能觸發(fā)別的免疫應答途徑［2］。

昆蟲有一個高效的先天免疫系統(tǒng)來區(qū)別異己成分和消除外源入侵物。先天性免疫應答系統(tǒng)產(chǎn)生的抗菌肽可以對微生物感染作出迅速有效的免疫應答［3，4］。LPS 是眾所周知的病原體相關分子模式(PAMP)，能引起昆蟲的先天免疫應答，而siRNA作為外源物質(zhì)，是否也被當做異物識別，發(fā)生免疫應答反應，至今鮮見報道。

在這個研究里，我們報道了家蠶在 LPS和siRNA誘導后黑化作用相關基因的轉錄水平，相關基因表達量的相似說明siRNA在家蠶先天免疫應答中也能充當PAMP。

2 材料和方法

2.1 材料

家蠶品種為本研究室保存的大造，正常桑葉育。LPS購自Sigma公司，Trizol RNA提取及M-MLV反轉錄試劑及其它化學常規(guī)試劑均購自寶生物工程(大連)有限公司，引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。

2.2 方法

2.2.1 家蠶幼蟲注射有效siRNA及LPS

取5齡第4天幼蟲，實驗組每頭家蠶幼蟲注射10μL LPS(150mmol/L NaCl溶解，終濃度1mg/mL)，對照組每頭幼蟲注射10μL 150mmol/L NaCl。分別在注射后9h取實驗組和對照組幼蟲的血淋巴。每組至少取10頭家蠶幼蟲。

將適量的siRNA溶于不含有RNA酶的無菌水中，輕輕混勻，siRNA為10μg/μL。取5齡第4天幼蟲，實驗組每頭家蠶幼蟲注射10μL siRNA，對照組每頭幼蟲注射10μL無菌水，分別在注射后24h后取實驗組和對照組的血淋巴，每組至少取10頭家蠶幼蟲。

2.2.2 樣品制備

取5齡第4天幼蟲，在冰上剪腹足取血淋巴，－80℃冷凍保存。

2.2.3 RNA提取和反轉錄PCR(RT-PCR)

用Trizol(TaKaRa公司)試劑盒說明書分別提取組織總RNA，用M-MLV反轉錄試劑盒(TaKaRa公司)反轉錄為為cDNA。

2.2.4 PO活性分析

LPS 注射后 3h、6h、9h、12h、18h、24h、48h 取家蠶的血淋巴，PO活性檢測用L-多巴作為底物，固定波長490nm。取96孔U形板，在每個微孔內(nèi)加入28℃下預溫育的300μL 0.1mol/L PH=6的磷酸鹽緩沖液，10μL 0.01mol/L 的 L-多巴及10μL 血清，酶標儀震蕩4次，立即測反應體系的吸光值，每隔2min讀一次吸光值，共10次。

2.2.5 基因表達分析

采用Primer 5.0軟件，引物如表1所示。采用SYBR PrimeScriptTM RT-PCR試劑盒測定具體步驟按照說明書進行，反應程序為:95℃預變性1 min，95℃變性15s，60℃退火30s，循環(huán)45 次。

表1 實時熒光定量PCR反應體系

反應過程由ABI7300熒光定量PCR儀(Applied Biosystems公司)軟件自動設定，每個樣品重復3次。

表2 實時熒光定量PCR的檢測基因和內(nèi)參照基因的引物

3 結果

3.1 血淋巴PO活性分析

在用LPS處理后檢測家蠶幼蟲血淋巴的PO活性，結果顯示LPS處理后PO活性是先升高再降低，PO活性在LPS處理后的3h、6h、9h后上升，9h時活性最高，PO活性在12h時開始降低，在18h時PO活性降到初始水平，見圖1。

圖1 LPS誘導不同時間后PPO活性變化

3.2 基因表達

LPS誘導和siRNA片段干擾后各基因的表達如圖2、3所示。

在用 LPS 誘導后 9h，Bmβ-1，3-GRPB2，Bm-PAEE，Bmserpin-3的表達量是上升的，而BmβGRP1，BmPPO2，BmDDC的表達量則下降，見圖2。

圖2 LPS誘導9h后各基因的mRNA相對表達量

在用siRNA片段干擾后24h，BmPPAE，Bmserpin-3 的表達量呈上升，而 BmβGRP1，Bmβ-1，3-GRPB2的表達量則下降，BmPPO2，BmDDC的表達量略下降，見圖3。

圖3 RNA干擾24h后各基因的mRNA相對表達量

4 討論

在哺乳動物里，dsRNA被認為是以病毒的分子模式引起先天免疫［5，6］。人類 TLR3作為激活 NF-kB途徑的dsRNA的PRR，生產(chǎn)Ⅰ型干擾素(IFN-a/b)［7，8］。在昆蟲方面，dsRNA 作為一個蛋白觸發(fā)先天免疫反應鮮為人知，而siRNA與dsRNA相似，猜想是否siRNA也能觸發(fā)昆蟲的先天免疫。

siRNA廣泛用于RNAi導致基因沉默。在鱗翅目昆蟲中，RNAi效率在不同物種、組織、時期和靶基因顯示相當多的變化［9］。我們的研究表明siRNA可以影響免疫相關基因的表達，或許可以解釋鱗翅目昆蟲RNAi的可變性之多。

LPS是眾所周知的病原體相關分子模式(PAMP)，能引起昆蟲的先天免疫應答，在用LPS誘導后，與模式識別受體(PRRS)相結合，進而激活免疫系統(tǒng)，如多酚氧化酶級聯(lián)(PPO)反應，我們先檢測LPS誘導后PPO的活性，發(fā)現(xiàn)其活性升高，推測可能參與黑化作用。

我們推測siRNA引起的免疫反應與LPS類似，因而檢測參與黑化作用的3類分子［10］，即識別分子，信號分子和效應分子相關基因表達量的變化。結果顯示，作為識別分子的 BmβGRP1，Bmβ-1，3-GRPB2，siRNA片段誘導后都下降，而LPS誘導后Bmβ-1，3-GRPB2上升，BmβGRP1 略下降，結果的不同可能是因為兩者都是針對于革蘭氏陰性菌的識別因子，而siRNA片段不屬于此類，作為信號(調(diào)節(jié))分子的 BmPPAE，Bmserpin-3，siRNA片段和 LPS誘導后都上升，作為效應分子 BmPPO2，BmDDC，siRNA片段和LPS誘導后都下降，但LPS誘導后下降幅度大。由此可知，兩種方式誘導后，各基因的表達模式基本相似，說明siRNA在家蠶先天免疫應答中也能充當PAMP。

［1］Yang M，Mattes J.Discovery biology and therapeutic potential of RNA interference，microRNA and antagomirs［J］PharmacolTher，2008，117(1):94 －104.

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［10］楊松.昆蟲黑化反應的分子機制研究進展［J］2003，30(4):164－168.