龐 博 劉貴建

(中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院廣安門(mén)醫(yī)院檢驗(yàn)科，北京100053)

血液細(xì)胞分析是對(duì)包括血液病在內(nèi)的多種疾病進(jìn)行診斷與鑒別診斷的重要手段。傳統(tǒng)的血液細(xì)胞分析主要依靠顯微鏡檢查，隨著分子生物學(xué)、免疫學(xué)等生命科學(xué)的發(fā)展，越來(lái)越多的疾病標(biāo)志物與免疫表型標(biāo)志物不斷涌現(xiàn)，使得通過(guò)分子標(biāo)志物對(duì)細(xì)胞進(jìn)行識(shí)別、分類成為可能。而現(xiàn)代自動(dòng)化儀器的技術(shù)和檢測(cè)方法也在快速進(jìn)步，這促使血細(xì)胞的自動(dòng)化分析在臨床上有了較為普遍的應(yīng)用。

近年來(lái)，全自動(dòng)血細(xì)胞分析儀已經(jīng)在臨床實(shí)驗(yàn)室普遍使用，流式細(xì)胞儀在一些大型教學(xué)醫(yī)院、綜合性醫(yī)院也開(kāi)始較多的使用，血液數(shù)字化圖像分析設(shè)備也開(kāi)始進(jìn)入臨床實(shí)驗(yàn)室。新的血液細(xì)胞檢驗(yàn)技術(shù)仍在不斷涌現(xiàn)，自動(dòng)化、流水線化、數(shù)字化與圖像化成為其主要發(fā)展趨勢(shì)。本文現(xiàn)對(duì)血液細(xì)胞分析技術(shù)的臨床應(yīng)用和進(jìn)展進(jìn)行簡(jiǎn)要綜述。

1 全自動(dòng)血細(xì)胞分析儀的應(yīng)用與進(jìn)展

20世紀(jì)中葉，庫(kù)爾特以電阻率變化為基礎(chǔ)研制了性能較穩(wěn)定的血細(xì)胞計(jì)數(shù)儀，這為臨床血細(xì)胞分析步入自動(dòng)化時(shí)代揭開(kāi)了序幕。時(shí)至今日，全自動(dòng)血細(xì)胞分析儀已在臨床上有了較為普遍的應(yīng)用，其檢測(cè)技術(shù)更為先進(jìn)，檢驗(yàn)項(xiàng)目更為豐富，呈現(xiàn)出功能多樣化、流水線化的特點(diǎn)。

1)多種檢測(cè)技術(shù)聯(lián)合應(yīng)用:在血細(xì)胞自動(dòng)分析儀的應(yīng)用早期，主要依靠單一的電阻法技術(shù)，可將細(xì)胞進(jìn)行基本識(shí)別與分群，如白細(xì)胞可通過(guò)體積分布直方圖分為淋巴細(xì)胞群、粒細(xì)胞群和中間細(xì)胞群3個(gè)部分。中間細(xì)胞群包括了嗜酸粒細(xì)胞、嗜堿粒細(xì)胞和單核細(xì)胞等，尚不能通過(guò)單一阻抗技術(shù)進(jìn)行區(qū)分，因而僅能實(shí)現(xiàn)白細(xì)胞的二分類或三分類。20世紀(jì)90年代后，一些五分類儀器得到臨床應(yīng)用，這些儀器有不同的技術(shù)組合形式，如采用電阻法聯(lián)合高頻電導(dǎo)和激光散射，電阻法聯(lián)合熒光染色和激光散射，細(xì)胞化學(xué)染色聯(lián)合激光散射，多角度偏振光散射法等技術(shù)方法。不同技術(shù)的特點(diǎn)各不相同，如高頻電導(dǎo)是針對(duì)細(xì)胞核質(zhì)比例等內(nèi)部特征進(jìn)行分析，激光散射則可分析細(xì)胞內(nèi)性質(zhì)不同的顆粒，熒光染色可以反映細(xì)胞內(nèi)核酸物質(zhì)的多少。不同種類白細(xì)胞內(nèi)含過(guò)氧化物酶的量不同，對(duì)其進(jìn)行細(xì)胞化學(xué)染色可以實(shí)現(xiàn)將其區(qū)分的目的。這些技術(shù)的組合應(yīng)用，可探測(cè)細(xì)胞的多種特征，從而實(shí)現(xiàn)了較為細(xì)致的分類。

2)優(yōu)化技術(shù)彌補(bǔ)不足:自動(dòng)化儀器大大節(jié)約了人工涂片計(jì)數(shù)分類所耗費(fèi)的時(shí)間與精力，但也存在一些不足。由于紅細(xì)胞(red blood cell，RBC)與血小板(platelet，PLT)的測(cè)量信號(hào)存在交叉，大的PLT會(huì)被誤認(rèn)為是RBC，而小的RBC則會(huì)進(jìn)行PLT通道參與計(jì)數(shù)，造成計(jì)數(shù)誤差。研究者們已將技術(shù)不斷優(yōu)化，以彌補(bǔ)這種不足。如二維光折射法可通過(guò)細(xì)胞體積和折射系數(shù)二維參數(shù)計(jì)數(shù)PLT，可以區(qū)分出PLT、小RBC、RBC碎片、RBC殘骸及電子噪音，在一定程度上提高了PLT計(jì)數(shù)的準(zhǔn)確性。有的儀器加用了標(biāo)記熒光的單抗簇分化抗原(cluster of differentiation，CD)61以促進(jìn)對(duì)血小板的識(shí)別。此外，還有掃流技術(shù)、防反流裝置、鞘流技術(shù)、浮動(dòng)界標(biāo)技術(shù)以及延時(shí)計(jì)數(shù)、擬合曲線等技術(shù)，也可以提高細(xì)胞計(jì)數(shù)的準(zhǔn)確性。

3)檢測(cè)參數(shù)不斷豐富:目前，全自動(dòng)血細(xì)胞分析儀也在不斷增加新的檢測(cè)功能，例如有的儀器增加了對(duì)網(wǎng)織紅細(xì)胞的識(shí)別功能，有的則增加了對(duì)幼稚細(xì)胞和有核紅細(xì)胞的分析，還有的儀器增加了流式細(xì)胞儀的功能，可以進(jìn)行CD4、CD8、CD3的測(cè)定，因而實(shí)現(xiàn)了對(duì)淋巴細(xì)胞亞群的分型［1］。盡管這類全自動(dòng)血細(xì)胞分析儀尚未在臨床上普遍應(yīng)用，但反映出了其功能擴(kuò)展化的趨勢(shì)，同時(shí)也應(yīng)注意到臨床上對(duì)于血細(xì)胞分類進(jìn)一步細(xì)化的需求越來(lái)越高［2］。

4)血液細(xì)胞分析的流水線化:近年來(lái)，血細(xì)胞分析儀逐漸發(fā)展成為全自動(dòng)流水線，不僅包括血液常規(guī)自動(dòng)化分析，而且通過(guò)自動(dòng)制片機(jī)實(shí)現(xiàn)了血片的制備，樣本篩選、涂片、編號(hào)、染色、干燥等一系列步驟均由機(jī)器自動(dòng)完成。根據(jù)常規(guī)檢測(cè)數(shù)據(jù)和直方圖的結(jié)果，儀器首先按照規(guī)則決定是否需要進(jìn)一步鏡檢，根據(jù)紅細(xì)胞情況決定是否需要網(wǎng)織紅細(xì)胞計(jì)數(shù)，根據(jù)紅細(xì)胞壓積來(lái)決定涂片的角度和厚度，從而將人工篩選、涂片的過(guò)程自動(dòng)化，使整個(gè)流程和操作趨向標(biāo)準(zhǔn)化［3］。

5)全自動(dòng)血細(xì)胞分析儀存在的缺陷:盡管全自動(dòng)血細(xì)胞分析儀在技術(shù)上已經(jīng)有了很大進(jìn)步，但仍有一些缺點(diǎn)尚未解決。如對(duì)于有核紅細(xì)胞、中性粒細(xì)胞的中毒顆粒、異型淋巴細(xì)胞、血小板聚集的衛(wèi)星現(xiàn)象可能存在一定的識(shí)別困難。有的儀器雖具備異常細(xì)胞識(shí)別與報(bào)警能力，但往往其敏感性過(guò)高，很難達(dá)到理想的預(yù)期效果。同時(shí)單靠?jī)x器也難以實(shí)現(xiàn)對(duì)球形紅細(xì)胞、點(diǎn)彩紅細(xì)胞、淚滴樣紅細(xì)胞、呈緡錢(qián)樣排列紅細(xì)胞等特殊形狀紅細(xì)胞的類型辨別。因此，為了獲得最為準(zhǔn)確的信息，應(yīng)充分認(rèn)識(shí)到自動(dòng)化技術(shù)的局限性，制定合理的復(fù)檢規(guī)則，將血細(xì)胞自動(dòng)分析儀與人工鏡檢結(jié)合起來(lái)。

2 流式細(xì)胞術(shù)的應(yīng)用與進(jìn)展

流式細(xì)胞術(shù)最早源于20世紀(jì)60年代后期的斯坦福大學(xué)，并在隨后對(duì)獲得性免疫缺陷綜合征患者的診療中得到認(rèn)可。發(fā)展至今，流式細(xì)胞術(shù)的用途得到了廣泛的擴(kuò)展，已成為臨床實(shí)驗(yàn)室較為常用的技術(shù)之一［4－5］。簡(jiǎn)單地說(shuō)，流式細(xì)胞術(shù)的原理就是把經(jīng)熒光染料標(biāo)記過(guò)的細(xì)胞樣品制成單細(xì)胞懸液，在鞘液的幫助下逐個(gè)排列，經(jīng)激光檢測(cè)區(qū)受其激發(fā)，產(chǎn)生散射光和熒光信號(hào)，經(jīng)光電倍增管和探測(cè)器轉(zhuǎn)變?yōu)殡娒}沖，進(jìn)入計(jì)算機(jī)，以各種參數(shù)的方式顯示出來(lái)，再利用軟件進(jìn)行分析。

1)流式細(xì)胞術(shù)在血細(xì)胞計(jì)數(shù)分類上的臨床應(yīng)用:流式原理對(duì)血細(xì)胞進(jìn)行技術(shù)與分型具有許多優(yōu)勢(shì)，其分析速度快，檢測(cè)指標(biāo)多，且可以將項(xiàng)目靈活組合，在多個(gè)臨床領(lǐng)域發(fā)揮著重要作用。在免疫學(xué)方面，可通過(guò)對(duì)不同CD分子的檢測(cè)來(lái)鑒定不同的免疫細(xì)胞類型，明確其所占比例，也可同時(shí)通過(guò)對(duì)細(xì)胞因子的檢測(cè)來(lái)了解不同免疫細(xì)胞的功能狀態(tài)，從而推測(cè)出患者所處的不同免疫狀態(tài)［6］。因此，流式細(xì)胞術(shù)對(duì)于多種免疫相關(guān)疾病均有著重要的應(yīng)用價(jià)值。在血液病方面，通過(guò)對(duì)其獨(dú)特抗原的分析，可對(duì)急性白血病、淋巴瘤進(jìn)行診斷，這對(duì)于那些通過(guò)形態(tài)學(xué)檢查難以得出結(jié)論的患者來(lái)說(shuō)尤為重要［7］。也可通過(guò)該技術(shù)檢測(cè)微小殘留病變，以了解白血病患者病情，及時(shí)采取措施避免復(fù)發(fā)［8］。此外，該技術(shù)還可對(duì)血小板功能進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)胞內(nèi)蛋白進(jìn)行分析，計(jì)數(shù)網(wǎng)織紅細(xì)胞，通過(guò)監(jiān)測(cè)外周血或干細(xì)胞采集物中干細(xì)胞的含量來(lái)了解造血干細(xì)胞移植患者免疫重建的狀況。

2)流式細(xì)胞術(shù)的多色應(yīng)用與可視化發(fā)展趨勢(shì):近年來(lái)，9色或10色等多色流式細(xì)胞術(shù)的應(yīng)用逐漸增加，其主要是針對(duì)白血病和淋巴瘤患者進(jìn)行診斷和病情監(jiān)測(cè)［9－10］。多色流式細(xì)胞術(shù)的優(yōu)勢(shì)在于可以實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞群進(jìn)行更為精確的鑒定，僅使用少量樣本便可獲取該細(xì)胞群的詳細(xì)信息，大大提高實(shí)驗(yàn)室工作效率，對(duì)少量異常細(xì)胞群實(shí)現(xiàn)持續(xù)監(jiān)測(cè)［10］。

普通的流式細(xì)胞術(shù)僅能對(duì)模擬信號(hào)進(jìn)行分析，無(wú)法直接觀察到細(xì)胞的形態(tài)和結(jié)構(gòu)，無(wú)法實(shí)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)的熒光信號(hào)定位。研究者為了克服這些缺點(diǎn)，研發(fā)了可視流式細(xì)胞分析儀，也稱為顯微成像流式細(xì)胞儀。它能夠?yàn)槊總€(gè)細(xì)胞生成12張圖片，以反映其真實(shí)影像。在圖片中能夠區(qū)分熒光在細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞膜和細(xì)胞核的定位。點(diǎn)擊散點(diǎn)圖中的每個(gè)點(diǎn)或直方圖中的信號(hào)點(diǎn)，便可觀察到相應(yīng)的細(xì)胞圖片。此外，使用者可以在FlowSight中觀察所設(shè)門(mén)內(nèi)外的細(xì)胞圖片，以此確認(rèn)設(shè)門(mén)是否準(zhǔn)確。這種可視功能無(wú)疑將大大拓展流式細(xì)胞術(shù)的分析能力，在一定程度上避免了設(shè)門(mén)不當(dāng)導(dǎo)致的計(jì)數(shù)分類錯(cuò)誤。

3 血細(xì)胞自動(dòng)數(shù)字圖像分析

為了最大限度地將血細(xì)胞分析工作自動(dòng)化、標(biāo)準(zhǔn)化和直觀化，人們又開(kāi)發(fā)了可將細(xì)胞形態(tài)直接顯示在屏幕上的自動(dòng)血細(xì)胞數(shù)字圖像分析系統(tǒng)。該系統(tǒng)是基于自動(dòng)模式進(jìn)行識(shí)別的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)分析方法運(yùn)行的，它可以實(shí)現(xiàn)自動(dòng)涂片、染色，并將100～200個(gè)白細(xì)胞進(jìn)行預(yù)分類計(jì)數(shù)，將這些白細(xì)胞全部顯示于顯示屏上，十分簡(jiǎn)便、快捷，且有利于標(biāo)準(zhǔn)化的實(shí)現(xiàn)。尤其對(duì)于異常形狀的白細(xì)胞、原始細(xì)胞和幼稚細(xì)胞的分類十分有益，也便于觀察紅細(xì)胞、血小板的形態(tài)，檢查寄生蟲(chóng)感染情況等。Cornet等［11］的研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)于多種血液學(xué)參數(shù)，DM96與人工鏡檢的一致性可達(dá)98%?？捎糜诩甭园籽〉妮o助診斷。Ceelie等［12］的研究則發(fā)現(xiàn)，DM96系統(tǒng)識(shí)別分葉核中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞以及幼稚細(xì)胞與人工鏡檢的一致性分別為98.6%、93.5%、84.7%、95.2%、94.0%、78.5%，而桿狀核中性粒細(xì)胞的一致性較差，為22.9%。在分析時(shí)間方面，該研究也對(duì)不同自動(dòng)形態(tài)分析儀進(jìn)行了比較，Octavia系統(tǒng)和DM96系統(tǒng)對(duì)每張涂片進(jìn)行100個(gè)白細(xì)胞的分析，平均耗時(shí)分別為5.4 min和3.2 min，而研究中較為熟練的人工操作則平均需要約4 min 的時(shí)間［12］。

自動(dòng)數(shù)字圖像分析技術(shù)節(jié)約了實(shí)驗(yàn)室工作人員的時(shí)間，便于教學(xué)和遠(yuǎn)程讀片會(huì)診［13］?？梢詫⑦@種血細(xì)胞自動(dòng)數(shù)字圖像分析工作系統(tǒng)納入到血液細(xì)胞自動(dòng)分析的流水線中，使得整個(gè)流程更為合理、便捷和標(biāo)準(zhǔn)化，這是未來(lái)現(xiàn)代化臨床實(shí)驗(yàn)室的一種理想模式。應(yīng)注意的是，這種數(shù)字圖像分析系統(tǒng)僅是一種預(yù)分類方法，人工確認(rèn)仍是保證準(zhǔn)確診斷的不可缺少的重要環(huán)節(jié)。自動(dòng)化與可視化技術(shù)的目的并非為了以機(jī)器分類替代人工識(shí)別，而是提高了涂片效率，增加了預(yù)篩選步驟，為讀片工作節(jié)約了更多的時(shí)間。

總之，可以預(yù)見(jiàn)，新的技術(shù)還會(huì)不斷涌現(xiàn)，血液細(xì)胞的分析工作將會(huì)變得更為便捷、準(zhǔn)確。自動(dòng)化、流水線化、可視性增強(qiáng)使得人工操作繁瑣費(fèi)時(shí)的狀態(tài)得到進(jìn)一步改善。對(duì)血細(xì)胞表面或內(nèi)部標(biāo)志物的分析，可以使其分類得到進(jìn)一步細(xì)化，以分子分型實(shí)現(xiàn)了傳統(tǒng)人工鏡檢所不能做到的分類方式，同時(shí)還可以對(duì)特定類型血細(xì)胞的功能進(jìn)行了解。但同時(shí)也應(yīng)注意，無(wú)論技術(shù)怎樣發(fā)展，自動(dòng)化分析儀器總有其內(nèi)在不足，人工鏡檢是血液細(xì)胞分析中的重要部分，具有自動(dòng)儀器檢測(cè)所不能替代的直觀、實(shí)用和經(jīng)濟(jì)優(yōu)勢(shì)。不斷發(fā)展的自動(dòng)化分析技術(shù)與傳統(tǒng)的人工鏡檢相互結(jié)合，才會(huì)真正更加有利于對(duì)疾病的準(zhǔn)確診斷和對(duì)病情的合理判斷。

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