王 珍，尤其嘉，楊靖亞，晁若瑜

（上海海洋大學(xué)海洋科學(xué)研究院，上海水產(chǎn)品加工及貯藏工程技術(shù)研究中心，上海201306）

鎘被美國(guó)毒物管理委員會(huì)（ATSDR）列為第6位危及人體健康的有毒物質(zhì)[1]。曾明等[2]研究表明，鎘對(duì)動(dòng)物的腎臟、肝臟都有不同程度的損害。陳敏等[3]研究表明，鎘有明顯的肝臟毒性。在實(shí)驗(yàn)研究之后，由于不再接觸鎘，肝臟作為解毒器官，肝臟功能會(huì)不同程度的恢復(fù)。Tahiri等[4]研究表明，果膠多糖對(duì)鉛的吸收有阻礙作用。劉培勛等[5]發(fā)現(xiàn)銀耳堿提多糖有一定清除自由基的能力。多糖的解毒作用可能與自由基的清除有關(guān)。張國(guó)升等[6]探討了蘆根多糖對(duì)四氯化碳小鼠肝損傷的保護(hù)作用。李立華等[7]研究發(fā)現(xiàn)蘆根多糖大、小劑量對(duì)模型大鼠血清AST含量均有降低作用，且多糖小劑量對(duì)白蛋白與球蛋白（A/G）比值也可起到升高作用。目前，蘆根多糖對(duì)鎘中毒的研究甚少，本實(shí)驗(yàn)將探討蘆根多糖對(duì)鎘中毒引起的小鼠肝和腎組織的損傷的保護(hù)作用，以期為蘆根多糖的開(kāi)發(fā)利用和鎘中毒的治療提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

蘆根 北京永安堂藥店；丙二醛（MDA）試劑盒、谷胱甘肽（GSH）試劑盒、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH-Px）試劑盒 南京建成生物工程研究所，20110711；高錳酸鉀、硫酸鋁鉀、蘇木素、伊紅、甘油、甲醛 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，分析純；SPF級(jí)健康昆明小白鼠50只 上海第二軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，18～22g。

LEICA RM2245切片機(jī)、LAICA HI1220烘片機(jī)、BM1000顯微鏡、TGL-20C冷凍離心機(jī)、UV1102紫外風(fēng)光光度計(jì) 上海圣科儀器公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 蘆根多糖的制備 按照本實(shí)驗(yàn)室的提取方法[8]，先將蘆根粗提取，采用Sevag法去蛋白，選取1.6cm×40cm凝膠層析柱進(jìn)行分離純化，冷凍干燥得到的蘆根多糖（包括三種多糖：R-PolyⅠ、R-PolyⅡ和R-PolyⅢ）備用。

1.2.2 動(dòng)物模型建立與灌胃解毒 SPF級(jí)健康昆明小白鼠50只，飼養(yǎng)一周。將小白鼠分為5組：正常組、模型組、多糖高劑量組、多糖中劑量組和多糖低劑量組。每組10只，雌雄各半。模型組、多糖高劑量組、多糖中劑量組和多糖低劑量組腹腔注射氯化鎘溶液2.5mg/（kg·d）；每周連續(xù)4d，連續(xù)5周[9]。

造模結(jié)束后，多糖高劑量組每天灌胃蘆根多糖480mg/（kg·d），多糖中劑量組灌胃240mg/（kg·d），多糖低劑量組灌胃120mg/（kg·d）[7]，共連續(xù)灌胃20d。正常組和模型組小鼠正常飼喂，正常飲水。

1.2.3 老鼠組織的表征觀察 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，各組老鼠禁食12h，解剖，觀察肝臟和腎臟的病變。

1.2.4 肝臟和腎臟組織的重量變化 老鼠禁食12h，解剖取肝臟和腎臟組織，用預(yù)冷的生理鹽水清洗干凈，濾紙吸去多余水分，稱量各組織塊重量及體重，計(jì)算肝臟系數(shù)和腎臟系數(shù)（見(jiàn)表1）。

1.2.5 肝腎組織石蠟切片 取解剖后的部分肝組織和腎組織，用冰生理鹽水清洗干凈血跡，濾紙吸干水分，將組織塊切成大小為0.5×0.5cm2的小方塊，制得切片，將玻片置于顯微鏡下觀察拍照，進(jìn)行病理形態(tài)學(xué)檢查。

1.2.6 肝腎組織的丙二醛（MDA）、谷胱甘肽（GSH）和谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH-Px）含量的測(cè)定 將小鼠肝、腎組織分別用生理鹽水漂洗脫血后制成10%的肝組織和腎組織勻漿，將制備好的勻漿用冷凍離心機(jī)離心10min（2000r/min），勻漿離心好后棄下面沉淀，留上清做后續(xù)的測(cè)定[10]。

1.2.6.1 肝腎組織的丙二醛（MDA）含量的測(cè)定 按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行測(cè)定，求得MDA的含量（見(jiàn)表2、表3）。

1.2.6.2 肝腎組織中的谷胱甘肽（GSH）含量的測(cè)定取待測(cè)肝、腎組織勻漿0.5mL，按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行測(cè)定，求得GSH的含量（見(jiàn)表2、表3）。

1.2.6.3 肝腎組織中谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH-Px）含量的測(cè)定 將10%的肝組織和腎組織勻漿稀釋至最佳濃度，按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行GSH-Px活性測(cè)定（見(jiàn)表2、表3）。

2 結(jié)果與分析

2.1 肝臟組織和腎臟組織的表征觀察

多糖灌胃結(jié)束后，小鼠禁食12h解剖觀察其肝臟和腎臟組織。正常組中小白鼠的肝臟和腎臟組織顏色均呈紅褐色，組織質(zhì)地均勻且邊緣銳利，被膜光滑有光澤。模型組每只小鼠的肝臟和腎臟均呈土黃色，邊緣鈍圓，臟器無(wú)光澤且腫大。多糖低中劑量組小白鼠的肝臟和腎臟均呈土黃色，邊緣鈍圓，臟器無(wú)光澤且腫大。多糖高劑量組小白鼠的肝臟腎臟略見(jiàn)腫大，邊緣稍有鈍圓，組織顏色依舊呈紅褐色。

2.2 肝臟系數(shù)和腎臟系數(shù)

各組小白鼠解剖后的肝臟和腎臟，用電子天平稱量濕重量，以小鼠肝臟重量、腎臟重量與其體重之比，分別記算肝臟系數(shù)和腎臟系數(shù)（見(jiàn)表1）。從表1中可以看出，模型組小鼠的肝臟系數(shù)和腎臟系數(shù)較正常組大。多糖三劑量組中，多糖高中劑量組可不同程度的緩解肝臟、腎臟損傷。

2.3 肝臟組織和腎臟組織的石蠟切片

各組小白鼠肝臟組織病理切片經(jīng)40倍顯微鏡觀察結(jié)果見(jiàn)圖1～圖5。從圖1～圖5中可見(jiàn)，正常組小白鼠的肝細(xì)胞緊密的排列在一起，細(xì)胞核的輪廓比較清楚，肝血竇成放射狀并且走向比較清晰。模型組小白鼠的肝細(xì)胞則多腫脹壞死，細(xì)胞核染色較淡或沒(méi)有顏色，肝血竇的走向混亂。多糖低劑量組和中劑量組小白鼠的肝細(xì)胞有部分腫脹壞死，細(xì)胞輪廓難以觀察清楚，細(xì)胞核染色也較淡。多糖高劑量組小白鼠的肝細(xì)胞則稍優(yōu)于低、中劑量組的，肝細(xì)胞腫脹壞死的情況極少，可觀察到細(xì)胞輪廓，且肝血竇的走向清晰呈放射狀。

各組小白鼠腎臟組織的病例切片見(jiàn)圖6～圖10。由圖6～圖10可見(jiàn)，正常組小白鼠的腎細(xì)胞排列緊密，細(xì)胞核可明顯觀察到，且核大小均一。模型組小白鼠的腎小管上皮細(xì)胞多腫脹壞死，細(xì)胞間的間隙變大。多糖低、中劑量組小鼠的腎小管上皮細(xì)胞大部分也都腫脹壞死，細(xì)胞間隙也逐漸變大。而多糖高劑量組小鼠的腎小管上皮細(xì)胞雖有少數(shù)腫脹情況發(fā)生，但卻排列依然緊密，細(xì)胞之間的間隙沒(méi)有多糖低、中劑量組的大。

2.4 肝臟和腎臟組織的MDA、GSH、GSH-Px含量

各藥物組對(duì)鎘中毒小鼠的肝損傷和腎損傷的保護(hù)作用見(jiàn)表2、表3。由表2、表3可知，模型組小鼠肝組織和腎組織中MDA的含量明顯高于正常組，GSH和GSH-Px的含量與正常組相比則極低。說(shuō)明鎘中毒小鼠模型建立成功。模型組小鼠肝組織、腎組織中的MDA、GSH和GSH-Px的含量是五個(gè)組中最高的；正常組肝組織、腎組織中的MDA、GSH和GSH-Px的含量則是五個(gè)組中最小的。蘆根多糖高、中、低三劑量組小鼠肝和腎組織中的MDA含量高于正常組，低于模型組；GSH和GSH-Px的含量處于正常組和模型組之間，這說(shuō)明不同濃度的蘆根多糖對(duì)鎘引起的小鼠肝、腎損傷均具有不同程度的保護(hù)作用，且呈濃度依賴性。其中，蘆根多糖高劑量組小鼠的各項(xiàng)指標(biāo)極接近正常組，其對(duì)小鼠的組織損傷保護(hù)作用最有效。

3 結(jié)論與討論

本文通過(guò)動(dòng)物建模探究蘆根多糖對(duì)鎘中毒的肝腎的解毒作用。蘆根多糖對(duì)鎘中毒小鼠的肝腎損傷的保護(hù)作用可能與蘆根多糖的抗氧化性有關(guān)。鎘通過(guò)與酶類(lèi)巰基結(jié)合或替代作用，置換出細(xì)胞內(nèi)酶類(lèi)金屬，降低機(jī)體抗氧化酶的活性，使機(jī)體清除自由基的能力下降，引起氧化損傷[11]。肝臟和腎臟是機(jī)體重要的代謝解毒器官，在機(jī)體代謝過(guò)程中，門(mén)靜脈收集自腹腔流來(lái)的血液，血中的有害物質(zhì)及微生物抗原性物質(zhì)，將在肝內(nèi)被解毒和清除。谷胱甘肽（GSH）是一種天然含巰基三肽，是機(jī)體內(nèi)極為重要的抗氧化劑和自由基清除劑，可以和自由基、重金屬等結(jié)合，將毒物轉(zhuǎn)化為無(wú)害物而排出體外，使肝細(xì)胞膜穩(wěn)定性增加，保護(hù)肝細(xì)胞膜，促進(jìn)肝臟酶的活性，促進(jìn)肝臟的解毒與合成功能[12]。GSH-Px是機(jī)體內(nèi)廣泛存在的一種重要的過(guò)氧化物分解酶，它的生理功能是以GSH為基質(zhì)來(lái)促進(jìn)過(guò)氧化物的分解，從而起到抗氧化的作用。因此GSH-Px活性高低意味著機(jī)體清除氧自由基的能力的強(qiáng)弱。MDA是生物膜脂質(zhì)過(guò)氧化的降解產(chǎn)物，其水平的高低體現(xiàn)了自由基的產(chǎn)生情況以及機(jī)體抗氧化系統(tǒng)的功能狀態(tài)。

蘆根多糖（R-PolyⅠ、R-PolyⅡ和R-PolyⅢ）組成為阿拉伯糖、葡萄糖、木糖，具有很強(qiáng)的抗氧化活性，具有清除生物體內(nèi)自由基的作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，蘆根多糖能夠增加GSH的含量，提高機(jī)體內(nèi)GSH-Px的活力，使機(jī)體的自由基防御處于較高水平，增強(qiáng)機(jī)體細(xì)胞的防御機(jī)制和解毒作用，機(jī)體的防御機(jī)制增強(qiáng)，抗氧化作用增強(qiáng)，那么細(xì)胞呼吸代謝過(guò)程中產(chǎn)生的過(guò)氧化物和羥自由基將被及時(shí)清除，而脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物MDA的含量自然降低。病理學(xué)形態(tài)切片顯示，不同劑量的蘆根多糖對(duì)肝腎細(xì)胞有一定的保護(hù)作用。本實(shí)驗(yàn)中蘆根多糖對(duì)鎘中毒小鼠的肝腎器官的保護(hù)作用可能與其抗氧化作用有關(guān)，這將為蘆根多糖的開(kāi)發(fā)利用和鎘中毒的治療提供一定的參考依據(jù)。

[1]黨衛(wèi)紅.鎘的毒性及鎘損害的營(yíng)養(yǎng)干預(yù)[J].鄭州輕工業(yè)學(xué)院報(bào)，2008（4）：10-12.

[2]曾明，王翔樸，安飛云，等.鎘中毒性肝腎損害的實(shí)驗(yàn)研究[J].中國(guó)公共衛(wèi)生，1999，15（10）：869-870.

[3]陳敏，謝吉民，程曉農(nóng)，等.鎘對(duì)小鼠肝臟的毒作用機(jī)理探討[J].江蘇大學(xué)學(xué)報(bào)：醫(yī)學(xué)版，2002，4：321-323.

[4]M Tahiri，JCTressol，T Doco，et al.Chronic oral administration of rhamnogalacturonan-II dimer，a pectic polysaccharide，failed to accelerate body lead detoxification after chronic lead exposure in rats[J].British Journal of Nutrition，2002，87（1）：47-54.

[5]劉培勛，高小榮，徐文清，等.銀耳堿提多糖抗氧化活性的研究[J].中藥藥理與臨床，2005（4）：35-37.

[6]張國(guó)升，樊明月，彭代銀，等.蘆根多糖對(duì)四氯化碳小鼠肝損傷的保護(hù)作用[J].中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)，2002，18（3）：354-355.

[7]李立華，張國(guó)升，戴敏，等.蘆根多糖對(duì)四氯化碳致肝纖維化大鼠的保肝作用[J].安徽中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2005，24（2）：24-26.

[8]沈蔚，任曉婷，張建，等.蘆根多糖的提取及其抗氧化活性的研究[J].時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2010（5）：1078-1080.

[9]霍俊鳳，董愛(ài)國(guó)，馬吉飛.姬松茸多糖對(duì)鎘中毒小鼠血液系統(tǒng)損傷的治療作用[J].中國(guó)獸藥雜志，2009（5）：27-29.

[10]趙紅霞.糖萜素對(duì)蝦生產(chǎn)性能和肉質(zhì)影響及機(jī)理研究[D].杭州：浙江大學(xué)，2003.

[11]刁書(shū)永，張立志，袁慧，等.鎘中毒機(jī)理研究進(jìn)展[J].動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2005（5）：49-51.

[12]曹秀虹，龐惠，趙民生，等.谷胱甘肽的臨床應(yīng)用進(jìn)展[J].中國(guó)綜合臨床，2002，18（9）：783.