孫 永，李紅艷，劉小如，鄧澤元

（南昌大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西南昌330047）

三葉青（Radix Tetrastigmae）為葡萄科植物三葉崖爬藤（Tetrastigma hemsleyanum Dielset Gilg）的塊根或全草，為我國(guó)特有珍稀植物[1]。分布于我國(guó)浙、贛、閩、粵、川、云、黔等省區(qū)[2]，可活血止痛、祛風(fēng)化痰、清熱解毒，用于肺炎、高熱驚厥、哮喘、咽痛、肝炎、瘰疬、月經(jīng)不調(diào)、風(fēng)濕等癥。三葉青提取物有消炎鎮(zhèn)痛、抗病毒等作用，廣泛應(yīng)用于民間治療病癥[3-5]。據(jù)報(bào)道，三葉青的化學(xué)成分主要為黃酮類化合物、還原糖、淀粉、氨基酸、甾類化合物等[6]。而三葉青葉片的的化學(xué)成分的報(bào)道相對(duì)較少，其主要含有黃酮類化合物和花青素類[7]。作為一種新興的超微細(xì)化技術(shù)，動(dòng)態(tài)超高壓微射流技術(shù)能對(duì)物料產(chǎn)生強(qiáng)烈剪切、高速撞擊、高頻振蕩、壓力瞬間釋放等一系列的綜合作用，從而導(dǎo)致細(xì)胞破碎，與此同時(shí)對(duì)活性成分幾乎沒(méi)有影響，并且能起到很好的超細(xì)化和均一化效果[8]。目前，動(dòng)態(tài)超高壓微射流技術(shù)被用于滅菌[9]、多糖提取[10]、蛋白質(zhì)改性[11-12]及淀粉改性[13-14]。運(yùn)用動(dòng)態(tài)超高壓微射流技術(shù)來(lái)提取黃酮的研究相對(duì)較少。本實(shí)驗(yàn)采用響應(yīng)面法優(yōu)化動(dòng)態(tài)超高壓微射流技術(shù)提取三葉青葉黃酮的工藝條件，提高三葉青葉黃酮的得率，為全面開(kāi)發(fā)和利用三葉青這一珍稀物種提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

三葉青 中國(guó)三葉青育苗基地提供，60℃干燥，粉碎后過(guò)200目篩；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥95%）中藥固體制劑制造技術(shù)國(guó)家工程研究中心；其余試劑 均為國(guó)產(chǎn)分析純。

M-700微射流均質(zhì)機(jī) 美國(guó)Microfluidics公司；GY50-6S高壓均質(zhì)機(jī) 上海華東高壓均質(zhì)機(jī)廠；722G可見(jiàn)分光光度計(jì) 上海精科儀器有限公司；METTLER-TOLEDO AL104電子分析天平 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；DFY-500搖擺式高速萬(wàn)能粉碎機(jī) 溫嶺市林大機(jī)械有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 準(zhǔn)確稱取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品5mg，溶解于95%乙醇中，再移入50mL容量瓶并用乙醇定容至刻度，得到濃度為0.1mg/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液。分別吸取標(biāo)準(zhǔn)液0.00、1.00、2.00、3.00、4.00、5.00mL置于10mL比色管中，并用95%乙醇加至5mL，加入5%的NaNO2溶液0.5mL，搖勻，放置6min后，加入10%的Al（NO3）3溶液0.5mL，搖勻，放置6min后，加入4%的NaOH溶液4mL，搖勻，放置15min，以試劑作空白參比液，在510nm處測(cè)定其吸光度，以蘆丁質(zhì)量濃度（C）為橫坐標(biāo)、吸光度（A）為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.2 三葉青葉黃酮提取的流程 三葉青葉粉末→60℃烘干（12h）→乙醇浸潤(rùn)（過(guò)夜）→高壓預(yù)均質(zhì)（30MPa，2次）→動(dòng)態(tài)超高壓微射流均質(zhì)→乙醇冷凝回流提?。?0℃，2次，合并提取液）→離心→抽濾→測(cè)定吸光度→計(jì)算黃酮得率。

1.2.3 三葉青葉黃酮得率的計(jì)算 取0.5mL提取液，按照1.2.1的方法測(cè)定其在510nm下的吸光度，按照下式計(jì)算黃酮的得率。

1.2.4 單因素實(shí)驗(yàn) 乙醇濃度，提取溫度、時(shí)間、次數(shù)，微射流均質(zhì)壓力、次數(shù)及料液比為影響三葉青葉黃酮得率的因素。通過(guò)考察文獻(xiàn)并結(jié)合前期研究，確定液料比為22mL/g，提取次數(shù)為兩次。本實(shí)驗(yàn)主要研究乙醇濃度、提取溫度和時(shí)間、微射流均質(zhì)壓力和次數(shù)五個(gè)因素對(duì)三葉青葉黃酮得率的影響。

1.2.5 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 以單因素實(shí)驗(yàn)為基礎(chǔ)，根據(jù)Box－Behnken的中心組合原理設(shè)計(jì)四因素三水平，選擇乙醇濃度、提取溫度和時(shí)間、微射流均質(zhì)壓力為自變量，并以X1、X2、X3、X4來(lái)表示，以－1、0、1代表不同變量水平進(jìn)行編碼[15]。實(shí)驗(yàn)因素水平及編碼見(jiàn)表1。

2 結(jié)果與分析

2.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程：A=6.7657C+0.0009，R2=0.9997，線性范圍：0～0.05mg/mL，在此范圍內(nèi)其吸光度值與濃度呈良好的線性關(guān)系。

2.2 單因素實(shí)驗(yàn)

2.2.1 乙醇濃度對(duì)三葉青葉黃酮得率的影響 分別稱取5.00g三葉青葉粉末，按液料比22mL/g加入分別為50%、60%、70%、80%、90%濃度的乙醇，浸泡過(guò)夜，經(jīng)30MPa預(yù)均質(zhì)后，立刻在100MPa微射流壓力下處理2次，70℃水浴提取1.5h，提取兩次。

由圖1可知，三葉青葉黃酮得率隨著乙醇濃度的上升而增大，并且在乙醇70%時(shí)達(dá)到最大值；隨著濃度的繼續(xù)上升，黃酮得率緩慢下降，其原因可能是當(dāng)乙醇濃度大于70%，葉綠素等脂溶性雜質(zhì)溶出影響黃酮類物質(zhì)的溶解。因此，選擇乙醇濃度為70%較合適。

2.2.2 提取溫度對(duì)三葉青葉黃酮得率的影響 提取溫度選擇50、60、70、80、90℃，以70%乙醇提取，其余條件同2.2.1。

由圖2可知，三葉青葉黃酮得率隨著提取溫度的上升而增加，且能顯著影響三葉青葉黃酮得率。但當(dāng)溫度超過(guò)70℃后，黃酮得率隨著溫度的上升而緩慢下降，其原因可能是三葉青葉黃酮中的某些活性成分被氧化分解。因此，選擇提取溫度為70℃較合適。

2.2.3 提取時(shí)間對(duì)三葉青葉黃酮得率的影響 提取時(shí)間選擇0.5、1、1.5、2、2.5h，以70%乙醇提取，其余條件同2.2.1。

由圖3可知，三葉青葉黃酮得率隨著時(shí)間的延長(zhǎng)先增加而后趨于平緩，在1.5h內(nèi)時(shí)，黃酮得率升高較快，而超過(guò)1.5h后，黃酮得率變化不大。因此，選擇提取時(shí)間為1.5h較合適。

2.2.4 微射流均質(zhì)壓力對(duì)三葉青葉黃酮得率的影響

微射流均質(zhì)壓力選擇60、80、100、120、140MPa，以70%乙醇提取，其余條件同2.2.1，并與普通提取和30MPa預(yù)均質(zhì)后提取比較。

由圖4可知，相對(duì)于普通提取和高壓預(yù)均質(zhì)后提取，微射流均質(zhì)后提取使得三葉青葉黃酮得率隨著均質(zhì)壓力的上升而顯著提高，其原因可能是均質(zhì)壓力越大細(xì)胞破碎程度越高，從而導(dǎo)致黃酮類物質(zhì)更完全的溶出。黃酮得率在壓力為100MPa時(shí)達(dá)到最大值。而后隨著均質(zhì)壓力的上升黃酮得率趨于平緩且略微下降。因此，微射流均質(zhì)壓力100Mpa時(shí)，黃酮得率最大。

2.2.5 微射流均質(zhì)次數(shù)對(duì)三葉青葉黃酮得率的影響

微射流均質(zhì)次數(shù)選擇1、2、3、4、5次，以70%乙醇提取，其余條件同2.2.1。

由圖5可知，三葉青黃酮得率開(kāi)始時(shí)隨著均質(zhì)次數(shù)緩慢上升隨后趨于平緩，但變化不大。因此，選擇微射流均質(zhì)次數(shù)為2次較合適。

2.3 響應(yīng)曲面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)的結(jié)果與分析

2.3.1 響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)結(jié)果 響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表2。通過(guò)SAS v9.2軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，根據(jù)Box－Behnken的中心組合設(shè)計(jì)原理，四因素三水平實(shí)驗(yàn)的取值見(jiàn)表1，共有27個(gè)實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)號(hào)1～24為析因?qū)嶒?yàn)，后面3個(gè)為中心實(shí)驗(yàn)。其中析因點(diǎn)為自變量取值在X1、X2、X3、X4所構(gòu)成的三維頂點(diǎn)，零點(diǎn)為區(qū)域的中心點(diǎn)，零點(diǎn)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，用以估計(jì)實(shí)驗(yàn)誤差。

2.3.2 擬合模型的建立 對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)經(jīng)回歸擬合后，得到X1（乙醇濃度）、X2（提取溫度）、X3（提取時(shí)間）和X4（微射流均質(zhì)壓力）與Y（三葉青葉黃酮得率）之間的回歸方程為：

2.3.3 方差分析 對(duì)三葉青葉黃酮得率進(jìn)行響應(yīng)曲面回歸分析，其結(jié)果見(jiàn)表3。

由表3可知，各因素對(duì)三葉青葉黃酮得率的影響為：微射流均質(zhì)壓力＞提取溫度＞提取時(shí)間＞乙醇濃度。本模型的p＜0.0001，說(shuō)明該模型具有高度的顯著性。本實(shí)驗(yàn)中X4（微射流均質(zhì)壓力）的一次項(xiàng)對(duì)三葉青葉黃酮得率呈極顯著水平，X2（提取溫度）的一次項(xiàng)呈顯著影響。X1（乙醇濃度）、X2（提取溫度）、X3（提取時(shí)間）的二次項(xiàng)呈顯著影響。而X1、X2、X3、X4四者之間的交互作用影響不顯著。同時(shí)，該模型的R2=0.9588，且模型誤差顯著、失擬誤差不顯著，變異系數(shù)（CV=2.285）較小，說(shuō)明此模型能夠較好的擬合實(shí)際實(shí)驗(yàn)。因此，可用該模型代替實(shí)驗(yàn)真實(shí)點(diǎn)對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)。

2.3.4 最佳條件的確定及驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn) 通過(guò)SAS軟件分析得到微射流均質(zhì)提取三葉青葉黃酮的最佳條件為：乙醇濃度75%、提取溫度70℃、提取時(shí)間1.5h、微射流均質(zhì)壓力120MPa，在此條件下三葉青葉黃酮得率的理論預(yù)測(cè)值為3.52%。然后，按照上述條件做3次平行實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證，得到三葉青葉總黃酮得率的平均值為3.49%。與理論預(yù)測(cè)值3.52%相比誤差僅為0.03%，因此，采用響應(yīng)曲面法得到的最佳條件具有實(shí)用價(jià)值。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)研究了動(dòng)態(tài)超高壓微射流對(duì)三葉青葉黃酮得率的影響。通過(guò)響應(yīng)曲面法確定了微射流均質(zhì)熱醇提取三葉青葉黃酮的最佳條件：乙醇體積75%、提取溫度70℃、提取時(shí)間1.5h，微射流均質(zhì)壓力120MPa、微射流均質(zhì)次數(shù)2次、液料比22mg/mL、提取次數(shù)2次。此時(shí)，三葉青葉黃酮得率為3.49%。

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