徐佳 向志雄 劉海燕

（上海醫(yī)藥集團(tuán)股份有限公司中央研究院 上海 201203）

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（RA）是一種常見且頑固的慢性全身性自身免疫系統(tǒng)疾病，多數(shù)免疫抑制劑對(duì)機(jī)體免疫系統(tǒng)的作用缺乏特異性和選擇性，毒副作用大，限制了其廣泛使用[1-2]。(5R)-5-羥基雷公藤內(nèi)酯醇（簡(jiǎn)稱T8）是我院正在開發(fā)的用于治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的一類創(chuàng)新藥物，與其先導(dǎo)化合物雷公藤內(nèi)酯醇相比，具有更強(qiáng)的成藥性[3]。該化合物目前已經(jīng)進(jìn)入I期臨床研究階段，需要評(píng)價(jià)其藥物-藥物相互作用的可能性。

P-gp是由多藥耐藥1基因（mdr1）編碼的ATP依賴性膜蛋白，作為藥物泵出轉(zhuǎn)運(yùn)子的P-gp可在許多組織中表達(dá)，是某些藥物的生物利用度低下和產(chǎn)生藥物-藥物相互作用或藥物-食物相互作用的原因[4-7]。P-gp分子上有多個(gè)藥物結(jié)合位點(diǎn)，故其底物范圍非常廣泛。由于P-gp底物和分布的廣泛性，在合用藥物時(shí)，可能發(fā)生競(jìng)爭(zhēng)性或非競(jìng)爭(zhēng)性的藥物相互作用，影響藥動(dòng)學(xué)過程，引起臨床療效的改變或產(chǎn)生毒性[8-9]。美國食品和藥品管理局（FDA）規(guī)定須從藥物代謝動(dòng)力學(xué)角度評(píng)價(jià)化合物是否是P-gp的底物或抑制劑[10]。

人類mdr1基因轉(zhuǎn)染犬腎上皮細(xì)胞系MDCK（Madin-Daby canine kidney）后形成 MDCK-MDR1細(xì)胞系，融合后形成不規(guī)則的多層細(xì)胞膜，P-gp 在上層細(xì)胞膜上高表達(dá)，專一性地用來判斷藥物是否是依賴P-gp轉(zhuǎn)運(yùn)的底物或抑制劑，可利用其作為腸道黏膜和血腦屏障藥物透過性的體外快速篩選模型[11-13]。我們利用MDCK-MDR1細(xì)胞模型快速預(yù)測(cè)T8是否是依賴P-gp介導(dǎo)的底物或抑制劑，為臨床藥物-藥物相互作用研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥品與試劑

培養(yǎng)基：高糖DMEM培養(yǎng)基 (Gibco)，含肝素 (國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司) 50 mg/L、谷氨酰胺（Gibco）200 mg/L（ 用 NaHCO3調(diào) pH 7.2 ～ 7.4）、雙抗生素（100 U/ml青霉素和 100 μg/ml鏈霉素，Gibco）10 ml/L、10%(v/v)胎牛血清 FBS（Gibco）、用 0.22 μm 微孔濾膜過濾除菌，4 ℃保存；胰蛋白酶0.25%(w/v)Trypsin-EDTA（Gibco）；熒光素鈉（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；阿替洛爾（中國藥品生物制品檢定所）；普萘洛爾（中國藥品生物制品檢定所）；紫杉醇（本院藥物制劑室）；Rho123（美國Sigma公司）；環(huán)孢素 A（美國Sigma公司，簡(jiǎn)稱CsA）；替硝唑（Sigma）；雙氯芬酸（中國藥品生物制品檢定所）；MDCK-MDR1細(xì)胞系； T8由我院合成室提供，結(jié)構(gòu)式見圖1。試驗(yàn)用水為滅菌去離子水，其他試劑均為國產(chǎn)分析純及以上規(guī)格。

圖1 T8的結(jié)構(gòu)式

1.1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

細(xì)胞電阻儀（Millicell-ERS voltohmmeter，美國Millipore 公司）；Millipore 插入式培養(yǎng)器（PCF 膜，膜孔徑0.4 μm，直徑12 mm，美國Millipore 公司）；24孔培養(yǎng)板（美國Corning公司）； 生物安全柜（美國Labconco公司）；CO2恒溫培養(yǎng)箱（美國Thermo Fisher Scientific公司）；TS100 型倒置顯微鏡（日本尼康公司）； CBS-47液氮罐； ZHWY-103B多振幅軌道式恒溫培養(yǎng)振蕩器（上海智城分析儀器制造有限公司）； 酶標(biāo)儀 （Thermo Varioskan Flash，美國Thermo Fisher Scientific公司）；API4000 QTRAP 型串聯(lián)質(zhì)譜儀（美國 Applied Biosystem公司），配有電噴霧離子源（ESI）以及Analyst 1.5.1 數(shù)據(jù)處理軟件；Waters Acquity UPLC 系統(tǒng)（美國 Waters 公司），包括四元輸液泵，自動(dòng)進(jìn)樣器。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

將需復(fù)蘇的細(xì)胞移至含20 ml高糖DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液的T-75組織培養(yǎng)瓶中置于37 ℃培養(yǎng)箱于5% CO2、飽和濕度的條件下培養(yǎng)，待細(xì)胞長(zhǎng)滿單層后進(jìn)行傳代點(diǎn)板，接種（1.5×105個(gè)細(xì)胞/ml）到轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)（Millipore 插入式培養(yǎng)器和24孔培養(yǎng)板組成轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)，見圖2）的PCF膜的AP側(cè)，每孔0.4 ml，以后每天換液培養(yǎng)至第4天進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

圖2 轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)圖示

1.2.2 MDCK-MDR1細(xì)胞模型的完整性考察

將MDCK-MDR1細(xì)胞培養(yǎng)至第4天，以熒光素鈉和阿替洛爾作為吸收性差的檢漏藥物對(duì)細(xì)胞模型進(jìn)行評(píng)價(jià)。轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)方案為將熒光素鈉（終濃度10 μmol/L）或阿替洛爾（終濃度1 μmol/L）分別從AP側(cè)給藥（接收側(cè)加入空白Hanks溶液，BL側(cè)0.6 ml），90 min后從BL側(cè)取細(xì)胞通透液（n=3）。

1.2.3 評(píng)價(jià)T8是否是P-gp的底物

細(xì)胞培養(yǎng)至第4天進(jìn)行轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)。第一組，在轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)兩側(cè)加入空白Hanks溶液（AP側(cè)0.4 ml，BL側(cè)0.6 ml），平衡10 min后輕輕吸出。轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)方案為將T8（終濃度1 μmol/L）和普萘洛爾（終濃度5 μmol/L）合用，分別從AP側(cè)和BL側(cè)給藥（接收側(cè)加入空白Hanks溶液，AP側(cè)0.4 ml，BL側(cè)0.6 ml），90 min后分別從BL側(cè)和AP側(cè)取細(xì)胞通透液（n=3）。第二組：分別在AP側(cè)和BL側(cè)加入含CsA終濃度為10 μmol/L的Hanks溶液（AP側(cè)0.4 ml，BL側(cè)0.6 ml），平衡10 min后輕輕吸出。轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)方案為將T8（終濃度1 μmol/L）和普萘洛爾（終濃度5 μmol/L）和P-gp抑制劑CsA（終濃度10 μmol/L）合用，分別從AP側(cè)和BL側(cè)給藥（接收側(cè)加入含CsA濃度為10 μmol/L的Hanks溶液，AP側(cè)0.4 ml，BL側(cè)0.6 ml），90 min后分別從BL側(cè)和AP側(cè)取細(xì)胞通透液（n=3）。以Rho123和紫杉醇為陽性對(duì)照（也合用普萘洛爾為內(nèi)參物），方案為將上述轉(zhuǎn)運(yùn)方案中的T8（終濃度1 μmol/L）替換為 Rho123（終濃度 5 μmol/L）或紫杉醇（終濃度 5 μmol/L）。

1.2.4 評(píng)價(jià)T8是否是P-gp的抑制劑

細(xì)胞培養(yǎng)至第4天進(jìn)行轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)時(shí)，分別以Rho123和紫杉醇為底物、CsA為P-gp的陽性抑制劑。以Rho123為底物時(shí)，在轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)兩側(cè)加入空白Hanks溶液（AP側(cè)0.4 ml，BL側(cè)0.6 ml），平衡10 min后輕輕吸出，第一組轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)方案為將Rho123（終濃度5 μmol/L）和普萘洛爾（終濃度5 μmol/L）合用，分別從AP側(cè)和BL側(cè)給藥（接收側(cè)加入空白Hanks溶液，AP側(cè)0.4 ml，BL側(cè)0.6 ml），90 min后分別從BL側(cè)和AP側(cè)取細(xì)胞通透液（n=3）。第二組轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)方案為將Rho123（終濃度5 μmol/L）和普萘洛爾（終濃度5 μmol/L）和CsA（終濃度10 μmol/L）合用，分別從AP側(cè)和BL側(cè)給藥（接收側(cè)加入含CsA終濃度為10 μmol/L的Hanks溶液，AP側(cè)0.4 ml，BL側(cè)0.6 ml），90 min后分別從BL側(cè)和AP側(cè)取細(xì)胞通透液（n=3）。第三組轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)方案為將Rho123（終濃度5 μmol/L）和普萘洛爾（終濃度5 μmol/L）和T8（終濃度1 μmol/L）合用，分別從AP側(cè)和BL側(cè)給藥（AP側(cè)0.4 ml，BL側(cè)0.6 ml），90 min后分別從BL側(cè)和AP側(cè)取細(xì)胞通透液（n=3）。第四組轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)方案為將Rho123（終濃度5 μmol/L）和普萘洛爾（終濃度5 μmol/L）和 T8（終濃度 5 μmol/L）合用，分別從 AP側(cè)和BL側(cè)給藥（AP側(cè)0.4 ml，BL側(cè)0.6 ml），90 min后分別從BL側(cè)和AP側(cè)取細(xì)胞通透液（n=3）。以紫杉醇為底物，方案為將上述轉(zhuǎn)運(yùn)方案中的Rho123（終濃度5 μmol/L）替換為紫杉醇（終濃度 5 μmol/L）。

1.2.5 樣品處理方法

100 μl細(xì)胞通透液加入100 μl含內(nèi)標(biāo)替硝唑（0.1 μg/ml）的乙腈，混合10 min沉淀蛋白，離心（6 000 g，10 min）后取70 μl加入96孔板，用串聯(lián)質(zhì)譜儀對(duì)化合物T8和陽性對(duì)照紫杉醇、阿替洛爾和普萘洛爾進(jìn)行定量測(cè)定。T8的內(nèi)標(biāo)為含0.5 μmol/L的雙氯芬酸，陽性對(duì)照紫杉醇、阿替洛爾和普萘洛爾的內(nèi)標(biāo)為0.1 μg/ml的替硝唑。

1.2.6 樣品測(cè)定方法

1）色譜條件 色譜柱 ：BEH C18（1.7 μm，50 mm× 2.1 mm 內(nèi)徑，美國Waters 公司）；流速：0.3 ml/min；柱溫：30 ℃；自動(dòng)進(jìn)樣器溫度：4 ℃；進(jìn)樣量：5 μl。

2）質(zhì)譜條件 離子源：電噴霧離子源（ESI），檢測(cè)方式： T8和雙氯芬酸為負(fù)離子檢測(cè)，其余化合物為正離子檢測(cè)；離子源溫度（TEM）： 400 ℃；霧化氣（Gas1，N2）壓力：50 psi；輔助氣（Gas2，N2）壓力：50 psi；氣簾氣（CUR）壓力：10 psi；掃描方式為多重反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）；碰撞氣（CAD，N2）壓力：中；用于定量分析的離子反應(yīng)如表1。

表1 質(zhì)譜條件

3） Rho123和熒光素鈉測(cè)定 用Thermo Varioskan Flash 酶標(biāo)儀測(cè)定Rho123和熒光素鈉此類質(zhì)譜響應(yīng)差但有熒光吸收的物質(zhì)。Rho123的激發(fā)波長(zhǎng)為498 nm 發(fā)射波長(zhǎng)為530 nm；熒光素鈉的激發(fā)波長(zhǎng)為491 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為514 nm。

1.2.7 數(shù)據(jù)分析

1）評(píng)價(jià)T8是否是P-gp的底物 表觀透過系數(shù)Papp的計(jì)算公式如下[10]：

公式中：表觀透過系數(shù)Papp（cm/s）反映藥物在腸上皮細(xì)胞中藥物的滲透能力；VR表示接收室的溶液體積（ml）；A表示膜的面積（此時(shí)A為0.6 cm2）；C0表示供試液中藥物的起始濃度(μg/ml)；dC/dt表示接收室在單位時(shí)間獲得的藥物濃度[μg/(ml·s)]。分別計(jì)算AP側(cè)向BL 側(cè)轉(zhuǎn)運(yùn)的Papp（AP-BL）和 BL 側(cè)向 AP 側(cè)轉(zhuǎn)運(yùn)的Papp(BL-AP)。外排比（Efflux Ratio）的計(jì)算公式如下：

MDCK-MDR1細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中以校正外排比（Corrected Efflux Ratio，CER）表示P-gp外排能力：

Efflux RatioMDR1為BL-AP以及AP-BL方向底物的表觀透過系數(shù)比值；Efflux RatioWILDTYPE為抑制劑CsA存在條件下底物兩個(gè)方向的表觀透過系數(shù)比值。

2） 評(píng)價(jià)T8是否是P-gp的抑制劑 抑制率（Inhibition Degree）按下式計(jì)算[14-15]

Papp(BL-AP)和Papp(AP-BL)分別為BL-AP以及AP-BL方向底物的表觀透過系數(shù)。iPapp(BL-AP)和iPapp(AP-BL)分別為抑制劑存在條件下底物兩個(gè)方向的表觀透過系數(shù)。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 MDCK-MDR1細(xì)胞模型的完整性考察

當(dāng)MDCK-MDR1細(xì)胞培養(yǎng)至第4天時(shí)，以熒光素鈉和阿替洛爾作為吸收性差的檢漏藥物、普萘洛爾為陰性對(duì)照（確定不是P-gp底物）、Rho123和紫杉醇為陽性對(duì)照（確定是P-gp底物）合并給藥，并且結(jié)合細(xì)胞的跨膜電阻和形態(tài)學(xué)指標(biāo)來對(duì)MDCK-MDR1細(xì)胞模型進(jìn)行評(píng)價(jià)。

1）光學(xué)顯微鏡觀察結(jié)果 可見細(xì)胞生長(zhǎng)均勻，邊界清晰（圖3）。

2）細(xì)胞的跨膜電阻（TEER值） 每天測(cè)電阻，電阻會(huì)呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，在第4天做轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)，Hanks溶液中的電阻約為 50～ 100 Ω·cm2。

3）檢漏標(biāo)記物 MDCK在Millicell PCF 膜上生長(zhǎng)4 d后，AP側(cè)到BL側(cè)方向，10 μmol/L熒光素鈉和1 μmol/L 的阿替洛爾的Papp分別為 9.79×10-7cm/s和8.81×10-7cm/s，滿足實(shí)驗(yàn)要求，和文獻(xiàn)報(bào)道一致[16]，表明MDCK-MDR1細(xì)胞間隙建立，細(xì)胞模型建立成功。

圖3 顯微鏡下MDCK 細(xì)胞形態(tài)（40×）

4）對(duì)照化合物 當(dāng) MDCK-MDR1細(xì)胞模型長(zhǎng)至第4天時(shí)，以普萘洛爾為陰性對(duì)照（確定不是P-gp底物），實(shí)驗(yàn)結(jié)果數(shù)值接近1；以Rho123和紫杉醇為陽性對(duì)照（確定是P-gp底物），實(shí)驗(yàn)結(jié)果數(shù)值大于2；表明MDCKMDR1細(xì)胞模型建立成功。

2.2 評(píng)價(jià)T8是否是P-gp的底物實(shí)驗(yàn)結(jié)果

結(jié)果（表2）提示T8是高透過性化合物，T8的外排比為1.07，F(xiàn)DA規(guī)定外排比大于2即為P-gp的潛在底物[10]，所以T8不是P-gp的潛在底物。

表2 T8的表觀透過系數(shù)和校正外排比

2.3 評(píng)價(jià)T8是否是P-gp的抑制劑實(shí)驗(yàn)結(jié)果

分別以Rho123（表3）和紫杉醇（表4）為底物時(shí)，1 μmol/L和5 μmol/L的T8對(duì)這兩個(gè)底物的轉(zhuǎn)運(yùn)沒有影響，外排比基本沒有改變，抑制率基本為0，因此T8不是P-gp的抑制劑。

3 討論

MDCK-MDR1 細(xì)胞培養(yǎng)周期短，代與代之間均一性良好，并且獲得了P-gp的高表達(dá)，因此是研究藥物雙向轉(zhuǎn)運(yùn)率、吸收轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制、預(yù)測(cè)體內(nèi)吸收和藥物相互作用、新藥設(shè)計(jì)、快速篩選及評(píng)價(jià)藥物安全性的一個(gè)較為理想的體外模型[14]。本研究結(jié)果表明T8的轉(zhuǎn)運(yùn)不受P-gp外排的影響，但是T8的轉(zhuǎn)運(yùn)過程是否存在其他影響因子（如其他多藥耐藥性蛋白、ATP 酶以及細(xì)胞間隙等因素）尚需進(jìn)一步的研究。

表3 以Rho123為底物的T8抑制率

表4 以紫杉醇為底物的T8抑制率

藥物進(jìn)出細(xì)胞的方式包括主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)、被動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)、細(xì)胞旁路通過及胞吞。熒光素鈉和阿替洛爾以細(xì)胞旁路通過的方式進(jìn)入細(xì)胞，因此采用其來檢測(cè)單層細(xì)胞的完整性，測(cè)定方法簡(jiǎn)單、快捷、可靠[16]。

本研究中選用普萘洛爾作為內(nèi)參物與T8以及每個(gè)P-gp底物共同給藥，目的是更好地監(jiān)測(cè)MDCK細(xì)胞上P-gp的功能，其校正外排比基本都在1左右或低于1。有文獻(xiàn)報(bào)道[17-18]普萘洛爾不受P-gp轉(zhuǎn)運(yùn)的影響，但可能對(duì)P-gp的功能有一定影響。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明普萘洛爾不影響P-gp的功能，因?yàn)殛栃运幍慕Y(jié)果都符合要求。

根據(jù)臨床前動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，預(yù)測(cè)I期臨床試驗(yàn)中最大給藥劑量為4～8 mg，推測(cè)人體最大血藥濃度0.5～1 μmol/L，因此底物實(shí)驗(yàn)中濃度設(shè)置為1 μmol/L，抑制劑實(shí)驗(yàn)中濃度設(shè)置為1 μmol/L 和 5 μmol/L。

總體結(jié)果表明T8既不是P-gp的底物也不是P-gp的抑制劑，因此在吸收、分布、代謝以及排泄階段T8與P-gp的抑制劑和底物發(fā)生相互作用的可能性很小。

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