朱 培 ，鐘海雁 ，2，黃衛(wèi)文 ，周 波 ，龔吉軍 ，趙清潔

（1.中南林業(yè)科技大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，湖南 長沙 410004；2.糧油深加工與品質(zhì)控制湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長沙 410004）

目前，多肽的測定方法包括柱前衍生反相高效液相色譜法、氨基酸自動(dòng)分析聯(lián)用法、差減法、電化學(xué)法以及電泳法[1-3]。其中，差減法、電化學(xué)法和電泳法測定多肽總量，無法確定多肽的種類；液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀在測定多肽類化合物方面具有分離度好、靈敏度高、可進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定等優(yōu)點(diǎn)，但是該法對(duì)樣品的前處理要求高，時(shí)間長[4-5]。

薄層掃描法（TLC）也稱薄層光密度法，是薄層色譜技術(shù)與光掃描儀和微型電子計(jì)算機(jī)結(jié)合起來的一種新型儀器分析方法。薄層掃描法對(duì)于樣品的前處理要求較低，并可同時(shí)對(duì)各種復(fù)雜的樣品進(jìn)行分離和測定[6]。薄層掃描法多應(yīng)用于蛋白質(zhì)和氨基酸的測量中，對(duì)于多肽的測量未見報(bào)道[7]。蛋白水解物因水解度的不同，樣品液中多肽的種類和含量也會(huì)不相同[8]，因此，測定多肽常用的高效液相色譜法則不能快速測定復(fù)雜多肽的含量，在多肽的企業(yè)化生產(chǎn)中使用有一定的局限性[9]。薄層掃描法可以對(duì)同一類物質(zhì)進(jìn)行測定，無需高度分離和純化。所以，用薄層掃描法測定蛋白水解物中的多肽的含量，在企業(yè)化生產(chǎn)中具有重要的意義。

1 材料及方法

1.1 材料與儀器

低溫冷榨粕采購于湖北通程；菌種由中南林業(yè)科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院自行篩選。

中草藥粉碎機(jī)：FW135型，天津泰斯特儀器有限公司。紫外分光光度計(jì)：UV1800，日本島津公司。薄層掃描儀：KH-3100型，上?？普苌萍加邢薰尽８咝б合嗌V儀：Prominence LC-20A，日本島津公司。

還原型谷胱甘肽標(biāo)準(zhǔn)品：購于上海源葉生物科技有限公司。顯色劑：0.5 g茚三酮溶于100 mL丙酮中[10]；其他化學(xué)試劑均為分析純。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 樣品液的配制

發(fā)酵條件：時(shí)間：5.14 d、接種量：10.16‰、溫度：31.71 ℃，進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵，低溫烘干至恒重，取發(fā)酵料10.00 g用蒸餾水在常溫下溶解、離心、定容100 mL；并用未發(fā)酵的原料做對(duì)照。

1.2.2 谷胱甘肽標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備

準(zhǔn)確稱取100.00 mg還原型谷胱甘肽標(biāo)準(zhǔn)品，用蒸餾水定容于100 mL容量瓶中，配成質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)液。取10 mL上述標(biāo)準(zhǔn)液于100 mL容量瓶中，用蒸餾水定容，配成0.1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)液備用。

1.2.3 色譜條件

薄層色譜：薄層板為硅膠G預(yù)制板；上行法展開15 cm；揮干溶劑，噴茚三酮顯色劑，在105 ℃加熱10～15 min[11]。

反向高效液相色譜條件：檢測波長230 nm；柱溫30 ℃；流速1.50 mL/min；上樣量25 μL；色譜柱C18柱（5.00 μm×25.00 cm× 4.60 mm）。

流動(dòng)相A為乙腈；流動(dòng)相B為水。

洗脫梯度：0～5 min，80%→10% A，維持10 min；15～20 min，10%→80% A。

2 結(jié)果與分析

2.1 展開劑的確定

發(fā)酵液中，除多肽外還存在一些氨基酸和小分子量蛋白質(zhì)。為獲得多肽的最佳分離效果，需對(duì)層析展開劑進(jìn)行選擇[12]。不同展開劑對(duì)蛋白水解物分離效果見表1，由表1可知，正丁醇＋乙酸＋水（體積比為4∶1∶1）的展開劑對(duì)多肽的分離效果較好，不僅層析斑點(diǎn)的比移值（Rf）值較大，斑點(diǎn)之間的Rf值差距也較大，而且斑點(diǎn)清晰。而其他展開劑均不利于多肽的分離，選正丁醇＋乙醇＋水（體積比為4∶1∶1）作為展開劑。

表1 不同展開劑對(duì)蛋白水解物的分離效果Table 1 Effect of different developing agents on separation of protolysate

2.2 掃描波長的確定

分別對(duì)還原型谷胱甘肽標(biāo)準(zhǔn)溶液、發(fā)酵溶液以及原料進(jìn)行全波段掃描，在波長為231 nm附近，谷胱甘肽標(biāo)準(zhǔn)溶液、發(fā)酵溶液以及原料溶液有最大吸光度。因此，可選231 nm為谷胱甘肽和發(fā)酵水解液中多肽的測定波長。

2.3 發(fā)酵液的薄層層析

分別對(duì)未發(fā)酵的原料、發(fā)酵水解液和不同質(zhì)量濃度的谷胱甘肽進(jìn)行層析展開，結(jié)果如圖1所示。

由圖1可知，點(diǎn)樣的3種不同的還原型谷胱甘肽標(biāo)準(zhǔn)液，只有1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品在圖譜上顯出了斑點(diǎn)，0.1 mg/mL的谷胱甘肽標(biāo)準(zhǔn)品不能在硅膠板上成像。這可能是由于標(biāo)準(zhǔn)品經(jīng)過展開劑稀釋后，濃度過低未能達(dá)到TLC的檢測線。因此，得出的結(jié)論是：采用薄層掃描法測定多肽的最低質(zhì)量濃度為1 mg/mL。

2.4 掃描結(jié)果

樣品掃描結(jié)果如表2所示。由表2可知：依據(jù)面積積分值和1 mg/mL的還原型谷胱甘肽標(biāo)準(zhǔn)品的面積對(duì)比，可得原料溶液中多肽含量為0.89mg/mL；發(fā)酵液多肽含量為1.82 mg/mL。

圖1 薄層薄板成像Fig.1 Thin layer plate chromatography

表2 樣品掃描結(jié)果Table 2 Scanning results of samples

2.5 重復(fù)性試驗(yàn)

對(duì)1 mg/mL谷胱甘肽標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行5次重復(fù)測定，結(jié)果見表3。變異系數(shù)（RSD）＜5%，說明采用薄層掃描法測定多肽含量，精密度高、重復(fù)性好[13]。

表3 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Repetition test result

2.6 回收試驗(yàn)

為了檢驗(yàn)該方法的準(zhǔn)確性，點(diǎn)樣2 μL油茶粕固態(tài)發(fā)酵液，同時(shí)加入2 μL谷胱甘肽標(biāo)準(zhǔn)液，以測定發(fā)酵液中的多肽含量，結(jié)果如表4。5次測得的平均回收率為106.94%，標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.058%。因此，該法準(zhǔn)確性較高。

表4 回收試驗(yàn)結(jié)果Table 4 Recovery result

2.7 與反向高效液相色譜法測定結(jié)果比較

本試驗(yàn)選取發(fā)酵液樣品，谷胱甘肽為標(biāo)準(zhǔn)品，分別用上述的方法與反向高效液相色譜法測定其多肽含量[14-15]，并做3次平行試驗(yàn)。結(jié)果見表5。薄層掃描法和反向高效色譜法測定結(jié)果由SPASS軟件分析得：薄層掃描法測定多肽含量均值為1.81 mg/mL，相對(duì)誤差為1.76%；而高效液相色譜法測定多肽含量均值為2.17 mg/mL，相對(duì)誤差為0.82%。獨(dú)立樣本T檢驗(yàn)結(jié)果：P＝0.283＞0.05，兩者無顯著性差異。而且薄層掃描法測定油茶粕蛋白水解物多肽所需設(shè)備簡單，樣品無需前處理、操作方法簡便，對(duì)于標(biāo)準(zhǔn)樣品的要求較低。薄層掃描法相對(duì)于反向高效液相色譜在測定油茶粕蛋白水解物多肽方面具有一定的優(yōu)勢。

表5 薄層掃描法與反向高效液相色譜法測定結(jié)果的對(duì)比Table 5 Comparison of determined results by TLC and RP-HPLC

3 結(jié)論與討論

本研究建立的TLC檢測油茶粕固態(tài)發(fā)酵蛋白水解物中多肽含量的方法，重復(fù)性標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.03%；回收試驗(yàn)的平均回收率為106.94%，且標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.058%。并且與高效液相色譜法進(jìn)行的對(duì)比，其結(jié)果無顯著性差異。

薄層掃描法測定油茶粕固態(tài)發(fā)酵蛋白水解物中多肽的含量具有一定的可行性，在確定展開劑及描述波長的基礎(chǔ)上，測定了該方法的重復(fù)性、加樣回收率。結(jié)果表明：以谷胱甘肽為對(duì)照品與油茶粕發(fā)酵液多肽進(jìn)行薄層分離，其TLC的重現(xiàn)性和加樣回收率等均符合含量測定要求；發(fā)酵液中多肽為1.82 mg/mL比原料液中的0.89 mg/mL約增加了1倍。

因此，采用薄層掃描法測定油茶粕蛋白水解物多肽具有靈敏、準(zhǔn)確、簡便等優(yōu)點(diǎn)，可以作為企業(yè)中快速檢測多肽的方法之一。研究結(jié)果為油茶餅粕蛋白及其活性成分的利用[16-19]提供可借鑒的方法。

參考文獻(xiàn)：

[1] 王建華. 尿中左旋咪唑的薄層掃描定量測定法[J]. 藥物分析雜志 ,1990,10(1)：12 － 15.

[2] 唐易全. 肽化學(xué)研究中的高效液相色譜[J]. 色譜,1990, 8(6)：368－372.

[3] 林 敏,曾慶煜,李耀曾. 薄層掃描法測定人血丙種球蛋白的純度[J]. 藥物分析雜志,1989,9(2)：1103－1107.

[4] Norfolk E. Comparison of amino acid separations on high performance silica gel, cellulose and C-18 reversed phase layers an application of HPTLC to the determination of amino acids inBiomphalaria GlabrataSnails [J]. J Lig Chromatogram, 1994,(17)： 13 － 17.

[5] Das B, Sawant S. Quantitative HPTLC analysis of dansylamino acids [J]. J Planar Chromatogram Mod TLC,1993,(6)：294 － 296.

[6] 邸 欣,崔升佐,孫敏慶. 用網(wǎng)格搜索尋優(yōu)法選擇分離6種青霉素類藥物的薄層色譜溶劑系統(tǒng)[J]. 色譜,1996,14(3)：211－215.

[7] 王緒明.薄層掃描法在生命科學(xué)中的應(yīng)用進(jìn)展[J]. 光學(xué)儀器,2000, 3(22)：33 － 39.

[8] Adler-Nissen J. Enzymic Hydrolysis of Food Proteins[M].London： El-sevier Applied Science Publishers,1986.

[9] 代衍峰.抗氧化性玉米肽蛋白的制備[D].無錫：江南大學(xué),2008： 29 － 48.

[10] 翟文慧,王愛月.紫外分光光度測定保健食品中谷胱甘肽[J].預(yù)防醫(yī)學(xué)論壇,2005,11(5)：560－561.

[11] 邵 偉,樂超銀,宋麗艷,等.大豆多肽發(fā)酵液中多肽測定方法的研究[J].中國釀造,2007,(5)：71－73.

[12] 天津輕工業(yè)學(xué)院,大連輕工業(yè)學(xué)院,無錫輕工業(yè)大學(xué),等.工業(yè)發(fā)酵分析[M].北京：中國輕工業(yè)出版,1980.

[13] 馬廣慈,唐伍寰,鄭斯成.藥物分析方法與應(yīng)用[M].北京：科學(xué)出版社,2000.

[14] 魯 偉,任國譜,宋俊梅.蛋白水解液中多肽含量的測定方法[J].食品科學(xué) ,2005,26(7)：169 － 171.

[15] 劉 揚(yáng),張占雄.多肽含量的測定方法的比較[J].內(nèi)蒙古石油化工 ,2008,(5)：65 － 68.

[16] 朱 培,鐘海雁.不同油茶餅粕成分比較與飼用可行性分析[J].經(jīng)濟(jì)林研究,2011, 29(1)：90－93.

[17] 朱 彬,鐘海雁,曹清明,等.油茶活性成分研究進(jìn)展與展望[J].經(jīng)濟(jì)林研究,2010, 28(3)： 140－145

[18] 胡芳名,譚曉風(fēng),仇 鍵,等. 油茶種子表達(dá)的主要儲(chǔ)藏蛋白基因及其分析[J]. 中南林學(xué)院學(xué)報(bào)，2005,25(4)：24－26, 45.

[19] 何 方.中國現(xiàn)代經(jīng)濟(jì)林產(chǎn)業(yè)體系建設(shè)布局研究Ⅰ——木本食用油料篇[J]. 中南林業(yè)科技大學(xué)學(xué)報(bào),2011,31(3)：1－7.