彭 兵，劉愛麗，何業(yè)華，胡桂兵，許文天，郭翠紅

（1.山東省肥城市林業(yè)局，山東 肥城 271600；2.華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝學(xué)院， 廣東 廣州 510640；3.商丘學(xué)院 風(fēng)景園林學(xué)院，河南 商丘 476113 )

荔枝Litchi chinensisSonn.屬于無(wú)患子科Sapindaceae荔枝屬Litchi Sonn.，是亞熱帶常綠喬木，是我國(guó)南方著名的果樹，為嶺南四大佳果之一。

目前我國(guó)荔枝的主栽品種大都是通過(guò)實(shí)生選種、芽變選種及常規(guī)雜交育種等手段培育的。然而，這些育種方法存在周期長(zhǎng)、占地多等缺點(diǎn)，一般來(lái)說(shuō)，從新品種的選育到通過(guò)審核投入生產(chǎn)要花十幾年的時(shí)間，這種發(fā)展速度遠(yuǎn)遠(yuǎn)滿足不了市場(chǎng)的需求[1]?，F(xiàn)代生物技術(shù)的迅速發(fā)展尤其是細(xì)胞工程和基因工程在理論和實(shí)踐上的突破，為植物的品種改良和植株快繁開辟了一條嶄新的途徑。但是，植物的基因工程育種在很大程度上仍然受到植株再生體系難易程度的影響。

荔枝離體再生體系的建立十分困難[2-4]。目前對(duì)其再生植株的研究多以胚為外植體[5-6]，而以莖段為外植體以建立穩(wěn)定離體培養(yǎng)體系的研究未見報(bào)道。文中以廣東省荔枝主要栽培品種“糯米糍”為試材，進(jìn)行了莖段愈傷組織的誘導(dǎo)和增殖試驗(yàn)，以期為荔枝的離體繁殖提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)于2008年9月在華南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院生物技術(shù)研究所進(jìn)行。供試材料為取自華南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院果園里7年生“糯米糍”荔枝樹的莖段。

1.2 研究方法

1.2.1 外植體的選取與消毒

在晴天的8：00～10：00，剪取荔枝半木質(zhì)化的嫩梢放入冰盒中帶回實(shí)驗(yàn)室。去掉葉片，并保留少許葉柄，選取帶腋芽的莖段和莖尖浸泡在濃度為400 mg/L的抗壞血酸溶液中30～40 min。然后轉(zhuǎn)至超凈工作臺(tái)上，用75%的酒精浸泡30 s，接著在0.1%的升汞中浸泡8 min，最后用無(wú)菌水沖洗3～4 次。消毒后將其切割成0.5～1.0 cm的莖段接種。所用抗壞血酸溶液、酒精、升汞和無(wú)菌水均曾存放于4 ℃的冰箱內(nèi)[7-8]。

1.2.2 不同取材時(shí)間對(duì)外植體生長(zhǎng)的影響

2008年7月～2009年7月，在果園荔枝苗圃選取長(zhǎng)勢(shì)一致、無(wú)病蟲害的“糯米糍”植株4株，每月中旬取材。以MS為基本培養(yǎng)基，附加BA 2.0 mg/L 、IBA 0.2 mg/L。每次接種40瓶，每瓶1個(gè)莖段，重復(fù)3 次。30 d后統(tǒng)計(jì)污染率、褐化率和成活率。

1.2.3 不同抗氧化劑抑制褐變的效果

外植體接種在MS＋BA 0.5 mg/L＋I(xiàn)BA 0.2 mg/L＋CH 500 mg/L的培養(yǎng)基中，分別添加抗氧化 劑 PVP（0.5、2.0、4.0 g/L）、Vc（0.5、2.0、4.0 g/L）、 AC（0.5、2.0、4.0 g/L），同時(shí)以不添加抗氧化劑為對(duì)照（CK）。每個(gè)處理接種20 瓶，每瓶1 個(gè)莖段，重復(fù)3 次。30 d后統(tǒng)計(jì)褐化率。

1.2.4 愈傷組織的誘導(dǎo)

采用單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)，每個(gè)處理接種10 瓶，每瓶1 個(gè)莖段，重復(fù)3 次。暗培養(yǎng)30 d后對(duì)愈傷組織的誘導(dǎo)率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

1.2.5 愈傷組織的增殖

采用單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)，探討不同培養(yǎng)基添加物對(duì)莖段愈傷組織增殖的影響。

1.2.6 培養(yǎng)條件

基本培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基，添加蔗糖30 g/L、瓊脂7 g/L、酸水解酪蛋白（CH）500 mg/L，pH值為5.7～5.8，培養(yǎng)溫度（26±2）℃。愈傷組織誘導(dǎo)暗培養(yǎng)，愈傷組織增殖轉(zhuǎn)為光下培養(yǎng)，光照時(shí)間為15 h/d，光強(qiáng)2 000～2 500 lx，相對(duì)濕度45%～57%。

1.2.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

接種30 d后統(tǒng)計(jì)外植體的污染率、褐化率、成活率和愈傷組織誘導(dǎo)率等指標(biāo)值[9]。

污染率＝污染的外植體數(shù)/接種的外植體數(shù)×100%；

褐化率＝褐化外植體數(shù)/接種未污染的外植體數(shù)×100%；

成活率＝成活外植體數(shù)/接種未污染的外植體數(shù)×100%；

愈傷組織誘導(dǎo)率＝產(chǎn)生愈傷組織的外植體數(shù)/接種成活的外植體數(shù)×100%；

愈傷組織增殖倍數(shù)＝25 d后愈傷組織重量/初始接種重量。

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)分析軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同取材時(shí)間對(duì)外植體污染、褐化的影響

在2008年7月～2009年7月期間的每月中旬取材，比較分析不同取材時(shí)間對(duì)外植體生長(zhǎng)的影響情況，結(jié)果如圖1所示。從圖1中可以看出，不同季節(jié)取材，外植體的污染率、褐化率和成活率明顯不同。11月至次年1月取材的污染率相對(duì)較低，在25%～30%之間，這可能是由于此段時(shí)間氣溫低，濕度小，內(nèi)生菌增殖速度較慢；4～6月取材的污染率相對(duì)較高，達(dá)到90%多，這可能是由于此時(shí)雨水漸多，氣溫逐漸升高，空氣濕度較大，內(nèi)生菌增殖快。褐化率的變化規(guī)律與污染率基本一致。從11月份到次年1月份褐變率相對(duì)較低，進(jìn)入生長(zhǎng)季節(jié)后，褐化率逐漸上升，4～6月褐化率最高，然后逐漸降低。但是，總體上看，荔枝褐化現(xiàn)象嚴(yán)重。成活率的變化規(guī)律與褐化率正好相反。

圖1 “糯米糍”莖段污染率、褐化率、成活率的年動(dòng)態(tài)變化規(guī)律Fig.1 Annual dynamic change of pollution rate, browning rate and survival rate of “Nuomici” stem segments

2.2 不同抗氧化劑抑制褐變的效果

荔枝組培難度大的原因之一是其酚類物質(zhì)含量高，當(dāng)外植體被切割后，切口附近細(xì)胞中酶與底物的分隔被破壞，在有氧存在的情況下，多酚氧化酶催化酚類物質(zhì)氧化成褐色的醌類，接種材料往往變褐死亡[2]。采用單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)，設(shè)置10個(gè)處理，比較了3種抗氧化劑對(duì)外植體褐變的影響，結(jié)果如表1所示。

表1 不同抗氧化劑對(duì)“糯米糍”莖段培養(yǎng)褐變的影響?Table 1 Effect of different antioxidants on browning of“Nuomici” stem segments

從表1中可以看出，聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、維生素C（Vc）、活性炭（AC）對(duì)抑制褐變均有一定的效果。外植體經(jīng)3種抗氧化劑處理后的褐化率均顯著低于對(duì)照（CK），且PVP與Vc、AC及對(duì)照間有顯著差異；PVP濃度為0.5 g/L的褐化率與濃度為2.0、4.0 g/L的褐化率之間存在著顯著差異，而2.0與4.0 g/L這兩種濃度處理的褐化率之間卻沒有顯著的差異。因此，PVP是較為理想的抗氧化劑，且適宜濃度為2.0 g/L。

2.3 不同生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)的影響

采用單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)，比較分析了不同植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)荔枝莖段愈傷組織誘導(dǎo)的影響情況，結(jié)果如表2和圖2所示。試驗(yàn)結(jié)果表明，A3培養(yǎng)基的誘導(dǎo)率最高，為90.5%，且與其他處理間存在顯著差異；A1培養(yǎng)基的誘導(dǎo)率最低，僅為40.6%，與其他處理間存在顯著差異（表2）。在不含2,4-D的培養(yǎng)基上，愈傷組織發(fā)生在莖段的整個(gè)表面，體積相對(duì)較?。ㄒ妶D2中的“1”和“2”小圖）；在含有2,4-D的培養(yǎng)基上，愈傷組織主要發(fā)生在莖段切口的兩端，其結(jié)構(gòu)疏松，顏色淡黃（見圖2中的“3”和“4”小圖）。因此，莖段愈傷組織誘導(dǎo)的適宜培養(yǎng)基為MS＋2,4-D 2.0 mg/L＋BA 0.5 mg/L＋PVP 2.0 g/L。

表2 不同生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)的影響Table 2 Effect of different plant growth regulators on callus induction

圖2 莖段愈傷組織的誘導(dǎo)狀態(tài)Fig.2 Status of callus induced from stem segment

2.4 不同培養(yǎng)基添加物對(duì)愈傷組織增殖的影響

在愈傷組織增殖培養(yǎng)過(guò)程中，向培養(yǎng)基中添加AgNO3對(duì)愈傷組織的形態(tài)結(jié)構(gòu)、分化途徑及增殖能力有一定的影響[10-11]。依據(jù)預(yù)備試驗(yàn)的結(jié)果，以BA 0.2 mg/L＋NAA 4.0 mg/L為對(duì)照，利用單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)，設(shè)14個(gè)處理，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表3和圖3、圖4。

表3 不同培養(yǎng)基添加物對(duì)愈傷組織增殖的影響Table 3 Effect of different additives on callus proliferation

圖3 不同生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)愈傷組織增殖的影響Fig.3 Effect of different plant growth regulators on callus proliferation

圖4 不同濃度的AgNO3對(duì)莖段愈傷組織增殖的影響Fig.4 Effect of different concentrations of AgNO3 on callus proliferation

在CK和C1～C5的培養(yǎng)基中，在C2即BA濃度為0.1 mg/L的培養(yǎng)基中愈傷組織的增殖倍數(shù)最高，達(dá)到2.08，這與其他培養(yǎng)基中愈傷組織的增殖倍數(shù)存在顯著差異。在BA濃度為0.2和0.3 mg/L的培養(yǎng)基中，愈傷組織表現(xiàn)為結(jié)構(gòu)致密，淡黃色，形態(tài)相對(duì)較好（見圖3中之“CK”與“C3”小圖）。在含有高濃度BA的培養(yǎng)基上連續(xù)培養(yǎng)3～4代后褐化現(xiàn)象嚴(yán)重。因此，結(jié)合愈傷組織的形態(tài)和生長(zhǎng)趨勢(shì)，篩選出的BA最佳濃度為0.1～0.3 mg/L。在CK與C6～C10的培養(yǎng)基中，在C9培養(yǎng)基中愈傷組織的增殖倍數(shù)最高，為1.65，與其他處理存在顯著差異。NAA濃度很低（0.1～0.3 mg/L）時(shí)，結(jié)構(gòu)疏松且表面為白色粉末狀的愈傷組織大量出現(xiàn)（見圖3中之“C6”與“C7”小圖）。在含有NAA1.0 mg/L的培養(yǎng)基上連續(xù)培養(yǎng)多代后，愈傷組織的形態(tài)主要表現(xiàn)為淡黃色，且在表面產(chǎn)生許多細(xì)小顆粒（見圖3之“C8”小圖）。因此，NAA的適宜濃度為1.0～3.0 mg/L。 CK、C11、C12、C13相比，CK的增殖倍數(shù)最高，與C12、C13的增殖倍數(shù)有顯著差異。愈傷組織在含有AgNO3的培養(yǎng)基上連續(xù)培養(yǎng)3代后褐化嚴(yán)重（見圖4中之“C11”、“C12”、“C13”小圖）。綜上所述，莖段愈傷組織的適宜增殖培養(yǎng)基為MS＋BA 0.1～0.3 mg/L＋NAA 1.0～3.0 mg/L＋CH 500 mg/L＋PVP 2.0 g/L。BA、NAA濃度過(guò)高或者過(guò)低都不利于愈傷組織的增殖。

3 結(jié) 論

在對(duì)“糯米糍”莖段培養(yǎng)試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，外植體的取材時(shí)間、取材部位和生理狀態(tài)對(duì)離體培養(yǎng)有重要影響。在冬季的11月份至次年1月份的晴天里取材，材料不易污染和褐化，存活率相對(duì)較高；冬梢的幼嫩部位是愈傷組織誘導(dǎo)的適宜取材部位。

荔枝莖段在所設(shè)培養(yǎng)基各個(gè)處理下均可不同程度地誘導(dǎo)出愈傷組織，愈傷組織的適宜誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS＋2,4-D 2.0 mg/L＋BA 0.5 mg/L＋PVP 2.0 g/L，其誘導(dǎo)率為90.5%，愈傷組織顏色淡黃，結(jié)構(gòu)疏松，體積大；適宜的增殖培養(yǎng)基為MS＋BA 0.1～0.3 mg/L＋NAA 1.0～3.0 mg/L＋CH 500 mg/L＋PVP 2.0 g/L，增殖倍數(shù)在1.5～2.1之間。這一試驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明，低濃度的BA和高濃度的NAA均有利于愈傷組織的增殖，這與蘇明申等人[12]在荔枝葉片上的研究結(jié)果相一致。

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