丁健峰，孫永海，付天宇，謝高鵬

(吉林大學生物與農(nóng)業(yè)工程學院，長春130022)

臨床醫(yī)學證明，威脅人類健康和生命的四十多種疾病都與人體缺硒有關［1－4］。硒不能在人體內(nèi)生物合成，必需從體外攝入。我國東北、西北、西南等所屬的15個省(市、區(qū))土壤含硒量低于臨界值的0.127mg/kg，其不同程度缺硒的縣(市)占全國縣(市)總數(shù)的72%［5］。目前，補硒劑主要有兩類，一類是無機硒，如亞硒酸鈉、硒酸鈉;另一類是有機硒，如有機硒制劑、富硒地區(qū)出產(chǎn)的食物。而無機硒均有劇毒，一般僅用于醫(yī)藥品而不用于食品，其使用范圍和劑量都受到限制。研究表明，有機硒化合物毒性遠低于無機硒化合物，且生物利用率更高［6］。所以，只有將無機硒轉化為有機硒，才具有普遍的食用和保健價值。

食用菌富集的有機態(tài)微量元素易于人體的吸收利用;且富集的微量元素穩(wěn)定性良好，便于貯存、運輸，可以避免其中的某些營養(yǎng)成分損失;攝取的微量元素在限制范圍內(nèi)，亦對人體無毒副作用［7］。目前人們已利用食用菌為載體培育出富硒靈芝、富硒金針菇、富硒平菇、富硒香菇和富硒猴頭菌等。

但國內(nèi)未見有關富硒羊肚菌菌絲深層發(fā)酵的報道。羊肚菌的子實體和菌絲體均含有豐富的營養(yǎng)成分，其氨基酸含量為食用菌之首，共含有19種氨基酸，是一種高營養(yǎng)低熱量的高級營養(yǎng)滋補佳品［8］。

鑒于無機硒轉化為有機硒的必要性及羊肚菌的藥用保健價值，本文采用羊肚菌菌絲體作為載體進行富硒培養(yǎng)，采用響應曲面法建立富硒羊肚菌深層發(fā)酵條件的數(shù)學模型，優(yōu)化富硒羊肚菌菌絲的深層發(fā)酵條件。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試菌種

粗柄羊肚菌926號:購于四川綿陽食用菌研究所。

1.1.2 藥品及試劑

土豆、酵母膏、蛋白胨、亞硒酸鈉、葡萄糖、硫酸鎂、磷酸氫二鉀、鹽酸、甲苯、硫酸、瓊脂粉、硝酸、高氯酸、EDTA、鄰苯二胺、硒標準溶液(濃度為100μg/ml購于天津市風船化學試劑科技有限公司)。

1.1.3 培養(yǎng)基

斜面培養(yǎng)基:馬鈴薯200 g/L，葡萄糖20 g/L，瓊脂15 g/L，KH2PO43g/L，MgSO41.5 g/L，水1000 mL，pH值自然。將土豆切成小塊煮沸約30 min煮至熟而不爛為止，四層紗布過濾，再配以其它藥品，定容、混合均勻，分裝后，121℃滅菌30 min，擺斜面放涼備用。

發(fā)酵培養(yǎng)基:馬鈴薯10%，蔗糖3%，蛋白胨0.1%，酵母膏0.5%，KH2PO40.05%，MgSO40. 05%。將土豆切成小塊煮沸約30 min煮至熟而不爛為止，四層紗布過濾，再配以其它藥品，定容、混合均勻，裝料量為100 mL/250mL，121℃滅菌30 min，放涼備用。

1.2 試驗儀器

電子萬用爐，天津市泰斯特儀器有限公司生產(chǎn);GB204型分析天平，瑞士METTLER TOLEDO公司生產(chǎn);SP－250C型恒溫恒濕箱，上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠生產(chǎn);DSX－280A型不銹鋼手提式滅菌器，上海市申安醫(yī)療器械廠生產(chǎn); PHS－3D型pH計，上海精密科學儀器有限公司生產(chǎn);HZQ－C空氣浴振蕩器，哈爾濱市東明醫(yī)療儀器廠生產(chǎn);CSF－1A型超聲波發(fā)生器，上海超聲儀器廠生產(chǎn);UV2300分光光度計，上海天美科學儀器有限公司生產(chǎn)。

1.3 試驗方法

1.3.1 富硒羊肚菌菌絲生物量的測定

菌絲生物量計算公式

式中:X為菌絲生物量，g/L;M為菌絲球干燥后的質量，g;V為發(fā)酵液的體積，L。

1.3.2 硒含量的測定

硒含量的檢測采用鄰苯二胺紫外分光光度法［9］，鄰苯二胺在酸性介質中與亞硒酸鹽反應生成3，4－苯并－1，2，5－重氮苤硒腦，用甲苯萃取，利用紫外分光光度計在335nm處測定萃取液的吸光度。

樣品處理:精確稱取一定量的樣品，研磨后放入磨口三角瓶中，加入濃硫酸10.0 mL，潤濕樣品，再加入濃硝酸－高氯酸(2:1)混合酸20.0 mL，放置過夜［10］。次日水浴加熱至棕黃色的NO2氣體產(chǎn)生，溶液變?yōu)樽攸S色后，繼續(xù)加熱，到白煙除盡為止，加入10.0 mL(濃鹽酸:蒸餾水=1:9)的鹽酸，繼續(xù)加熱5分鐘，即達到消化終點。取10. 0mL消化液與錐形瓶中，加水30.0mL，分別加入5%EDTA 2.0 mL和1%鄰苯二胺2.0 mL，用HCI調(diào)節(jié)溶液pH至2.0，混勻后室溫避光放置60 min，加入10.0 mL甲苯，大力振蕩4min，移入分液漏斗中靜置4 min。在335 nm波長下測定試液的吸光度，以空白樣做對比，測定試液的吸光度，對比標準曲線求出硒濃度。

硒標準曲線的制作:配置濃度為0.00，3.00，6.00，9.00，12.00，15.00，18.00，21.00μg/ml的硒標準溶液，測定各標準溶液的吸光度。以硒含量為橫坐標，吸光度為縱坐標繪制標準曲線，標準曲線見圖1。

圖1 硒含量的標準曲線Fig.1 Calibration curve of selenium

標準曲線方程為

式中:x為吸光度，A;Y為硒含量，μg/ml。

硒含量的測定與計算:將樣品消化后的待測液以適當倍數(shù)稀釋，同樣條件下測定其吸光度。根據(jù)標準曲線得出測試液的硒濃度。

1.4 試驗方案

1.4.1 單因素試驗

研究發(fā)酵時間(2、3、4、5、6 d)、培養(yǎng)溫度(22、24、26、28、30℃)、硒濃度(20、50、80、110、140μg/ml)以及搖床轉速(60、80、100、120、140 r/min)4個主要因素對富硒羊肚菌菌絲生物量和硒含量的影響情況。

1.4.2 響應面分析法優(yōu)化發(fā)酵條件

根據(jù)單因素試驗結果，使用Design－Expert數(shù)據(jù)分析軟件設計試驗，利用響應面分析法確定富硒羊肚菌的最佳發(fā)酵條件，做出二次回歸方程、響應面立體圖和等高線圖，確定最佳的發(fā)酵條件。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 發(fā)酵時間對富硒羊肚菌菌絲生物量的影響

羊肚菌進行深層發(fā)酵培養(yǎng)時，菌種接入一天后開始緩慢生長，到第五天末開始出現(xiàn)自溶現(xiàn)象，隨著發(fā)酵的繼續(xù)進行，菌絲體干重略有減少，如圖2所示。

圖2 發(fā)酵時間對羊肚菌菌絲生物量的影響Fig.2 Effect of time speed on M orchella esculentam ycelia biomass

2.1.2 培養(yǎng)溫度對富硒羊肚菌菌絲生物量的影響

選擇5個培養(yǎng)溫度梯度培養(yǎng)，富硒羊肚菌菌絲生物量的變化如圖3所示。由圖3可知，羊肚菌在22～30℃這一較大的溫度范圍內(nèi)都可以生長，26℃菌絲體生長最好，但是隨著溫度的進一步升高，得到的菌絲生物量明顯降低。

圖3 培養(yǎng)溫度對羊肚菌菌絲生物量的影響Fig.3 Effect of culture tem perature on M orchella esculentam ycelia biomass

2.1.3 硒濃度對富硒羊肚菌菌絲生物量的影響

本試驗中，對硒的富集情況進行了初步的研究。從圖4可以看出，硒對羊肚菌菌絲體的生長影響比較大，低濃度的硒對羊肚菌的生長有促進作用，但當硒的濃度超過80μg/m l時，隨著培養(yǎng)基中硒濃度的增加，菌絲生物量是逐漸降低的。

2.1.4 搖床轉速對富硒羊肚菌菌絲生物量的影響

選擇5個轉速梯度培養(yǎng)，富硒羊肚菌菌絲生物量的變化如圖5所示。從圖5中可以看出，在中等轉速100 r/min下所得到的菌絲生物量較高，且在80 r/min到120 r/min之間的轉速對羊肚菌菌絲生物量無顯著影響。因此，本試驗選擇搖床轉速為100 r/min。

圖4 硒濃度對羊肚菌菌絲生物量的影響Fig.4 Effect of Se concentration on M orchella esculenta m ycelia biomass

圖5 搖床轉速對羊肚菌菌絲生物量的影響Fig.5 Effect of shaking speed on M orchella esculenta mycelia biomass

2.2 響應面分析法優(yōu)化發(fā)酵條件

選取發(fā)酵時間(X1)、培養(yǎng)溫度(X2)、硒濃度(X3)作為試驗因子，富硒羊肚菌菌絲生物量(Y1)、硒含量(Y2)為響應值，利用響應面分析法優(yōu)化富硒羊肚菌發(fā)酵條件。其試驗設計因素編碼如表1所示，Box－Behnken試驗設計與結果如表2所示。

表3可見該模型的方差分析，該模型極顯著(P＜00001)，一次項中X1、X3達到了極顯著水平(P＜0.01);二次項中X1、X2、X3對菌絲生物量的影響都是極顯著(P＜0.01);交互項中X1和 X3、X2和X3對菌絲生物量有顯著性(R＜0.25)影響，而X1和X2交互作用不顯著。

表1 Box-Behnken試驗設計因素編碼Table 1 Factors and levels of Box-Behnken design

表2 Box-Behnken試驗設計與結果Table 2 Results of Box-Behnken design

表3 回歸方程各項的方差分析Table 3 Coefficients of themodel and ANOVA

表4 模型可信度分析Table 4 Reliability of the model

建立二次響應面模型，以菌絲生物量為響應值Y(g/L)，經(jīng)二次回歸擬合后得到響應函數(shù)，即回歸方程為:

通過模型可信度分析表可以看出，在用公式(3)描述各個因素與響應值之間的關系時，線性關系顯著(R2=0.9990)。由模型的方差分析表可以得到，模型的顯著水平P＜0.0001，此時回歸方差模型是極其顯著的，這種試驗方法是可靠的。通過表4的模型可信度分析可以看出各個因素值和響應值之間的關系可以用此模型來函數(shù)化，可以用此回歸方程來對試驗結果進行分析預測。

通過回歸方程來繪制分析圖，以考察所擬合響應曲面的形狀，響應曲面立體分析圖和相應等高線圖見圖6。

從圖6中可以看出，溫度和時間對菌絲生物量的影響都不太顯著，兩個曲面都比較平緩。等高線圖表明沿時間軸線等高線密集，說明時間對響應值的影響比溫度顯著。等高線成橢圓形說明兩者交互作用顯著。

圖7顯示，硒濃度對菌絲生物量的影響顯著，曲面較陡，隨著硒濃度高于80μg/mL后曲面相對變緩，可能已經(jīng)達到羊肚菌的富集能力極限，時間對于菌絲生物量的影響不顯著，曲面平緩，等高線呈現(xiàn)出橢圓形，說明交互作用較強，影響顯著。

從圖8中可以看出，硒濃度對菌絲生物量的影響顯著，曲面較陡，溫度對菌絲生物量的影響不太顯著，曲面相對緩和。由溫度和硒濃度的交互作用等高線可知，沿硒濃度軸線等高線密集，而溫度軸向等高線較稀疏，說明硒濃度對響應值峰值影響比溫度大，等高線呈橢圓形說明，兩者交互作用顯著，影響顯著。

圖6 Y=f(X1，X2)響應面立體圖和等高線圖ig.6 Three-dimensional response surface graphs and the contour p lots of extraction time versus ultrosonic power according to Y=f(X1，X2)

圖7 Y=f(X1，X3)響應面立體圖和等高線圖Fig.7 Three-dimensional response surface graphs and the contour plots of extraction time versus ultrosonic power according to Y=f(X1，X3)

為了進一步驗證試驗結果，在優(yōu)化的反應條件下進行重復試驗三次，得到菌絲生物量為10. 339 g/L，得到驗證值與實際值的相對誤差僅為0. 60%?；貧w方程所得硒產(chǎn)量的預測值與驗證試驗的平均值相接近，說明回歸方程能夠較真實地反映篩選因素對富硒羊肚菌菌絲生物量的影響，應用響應面法可以達到優(yōu)化富硒羊肚菌深層發(fā)酵條件的目的。

圖8 Y=f(X2，X3)響應面立體圖和等高線圖Fig.8 Three-dimensional response surface graphs and the contour plots of extraction time versus ultrosonic power according to Y=f(X2，X3)

3 結論

本試驗利用單因素試驗，研究了發(fā)酵時間、硒濃度、培養(yǎng)溫度、搖床轉速對富硒羊肚菌菌絲生物量的影響，利用響應曲面法對富硒羊肚菌菌絲深層發(fā)酵的條件進行了優(yōu)化，確定最佳發(fā)酵條件為培養(yǎng)溫度25.73℃、發(fā)酵時間為5.22 d、硒濃度為86.67μg/ml在此條件下富硒羊肚菌菌絲生物量的理論值達10.512 g/L，硒含量達到18.8μg/ m l，實際菌絲生物量的達到10.339 g/L、硒含量達到18.6μg/ml。

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