劉玉艷，儲(chǔ)順禮，李男男，包幸福，高 尚，沙 莉，胡 敏，蔣引珊

(1.吉林大學(xué)口腔醫(yī)院，長(zhǎng)春130041;2.吉林大學(xué)材料科學(xué)與工程學(xué)院，長(zhǎng)春130022)

羧甲基殼聚糖(N，O－CMC)及n－β－磷酸三鈣(n－β－TCP)是骨修復(fù)和支架材料的研究熱點(diǎn)［1－5］，但二者不同質(zhì)量比復(fù)合后的降解性能尚未見(jiàn)報(bào)道，因此，對(duì)不同質(zhì)量比的二者復(fù)合材料進(jìn)行了體外降解實(shí)驗(yàn)，以期為進(jìn)一步的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

3種不同質(zhì)量比的N，O－羧甲基殼聚糖(N，O－carboxymethyl chitosan，N，O－CMC)/納米β－磷酸三鈣(Nano－β－tricalcium phosphate，n－β－TCP)多孔復(fù)合材料為吉林大學(xué)實(shí)驗(yàn)室合成［6］。

1.2 體外浸泡實(shí)驗(yàn)

模擬體液(Simulated body fluid，SBF)的配制: SBF參考Kokubo［7］的方法進(jìn)行配制，具體步驟如下:將 7.995 g NaCl、0.353 g NaHCO3、0.224 g KCl、0.071 g Na2SO4、0.305 g MgCl2· 6H2O、0.228 g K2HPO4·3H2O和0.277 g CaCl2依次溶于900 mL蒸餾水中;將40 mL、1 mol/L的HCl緩慢加入到上述溶液中;在攪拌狀態(tài)下將6. 118 g(CH2OH3)3CNH2緩慢加入到上述溶液中，待其全部溶解后，攪拌均勻;用上述1 mol/L的HCl調(diào)節(jié)溶液pH為7.4，并定容1000 mL?，F(xiàn)用現(xiàn)配并經(jīng)過(guò)濾除菌、4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

首先將制備的復(fù)合材料塊體置于干凈的聚乙烯塑料瓶中，按照塊體質(zhì)量和SBF體積比為1 g/ 60 mL的比例，添加新配制的SBF溶液，再將聚乙烯瓶加蓋密封，置于37℃恒溫水浴鍋中，分別浸泡7 d、14 d、21 d、28 d。為保證模擬環(huán)境的離子濃度不變，一周換一次SBF溶液。浸泡結(jié)束后取出，用去離子水洗凈，60℃真空烘干后以備測(cè)試用。

1.3 復(fù)合材料浸泡后的性能表征和檢測(cè)

(1)SBF溶液pH值的測(cè)定

采用國(guó)產(chǎn)雷磁PHS－3C型數(shù)顯pH計(jì)測(cè)量不同浸泡時(shí)間、不同比例N，O－CMC/n－β－TCP復(fù)合材料降解液的pH值。各測(cè)試點(diǎn)分別取出3個(gè)平行樣，取平均值。

(2)浸泡前后復(fù)合材料質(zhì)量測(cè)試

將不同浸泡時(shí)間的多孔試樣取出，經(jīng)去離子水反復(fù)浸泡、洗滌干燥后，用高精密電子天平稱重，并按公式δ=(m－m0)/m0×100%計(jì)算其重量變化，其中m0和m分別為浸泡前后的質(zhì)量。若計(jì)算結(jié)果為正，說(shuō)明浸泡后增重，用增重率表示;若計(jì)算結(jié)果為負(fù)，說(shuō)明浸泡后失重，用失重率表示。各測(cè)試點(diǎn)分別取3個(gè)平行樣，取平均值。

(3)浸泡后復(fù)合材料的X射線衍射儀(XRD)測(cè)試

采用丹東方圓儀器有限公司的DX－2700 X射線粉末衍射儀對(duì)降解后樣品的表面相結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。采用Cu Kα(λ=0.15406 nm)射線，管電壓為35 kV，管電流為25 mA，掃描范圍為10°～60°，掃描步寬為0.03°/s，采樣時(shí)間為0.5 s。

(4)浸泡后復(fù)合材料的FTIR測(cè)試

采用美國(guó)Nicolet公司的Nexus670傅里葉變換紅外光譜儀對(duì)降解后的樣品進(jìn)行官能團(tuán)結(jié)構(gòu)分析測(cè)試，KBr壓片法，測(cè)量范圍為 400～4000 cm－1，分辨率為1 cm－1。

(5)不同浸泡時(shí)間復(fù)合材料鈣、磷離子濃度測(cè)試

使用美國(guó)PE公司的電感耦合等離子體發(fā)射光譜儀(型號(hào):Optima 2100DV)，測(cè)試條件如下:等離子體氣為15 L/min，輔助氣為0.2 L/min，霧化氣為0.80 L/min，發(fā)射功率為1300 W，進(jìn)樣速度為 1.50 mL/min。(參考方法為 BS EN ISO11885:2009電感耦合等離子體發(fā)射光譜法測(cè)水中33種元素)

2 結(jié)果

不同質(zhì)量比復(fù)合材料在模擬體液中浸泡28 d內(nèi)的pH值及質(zhì)量變化見(jiàn)圖1和圖2。從圖1可知，不同質(zhì)量比復(fù)合材料的pH值呈現(xiàn)相似的變化趨勢(shì)，既浸入SBF后，pH值在前5 d內(nèi)迅速降低，6～14 d開(kāi)始緩慢上升，隨后pH值基本處于穩(wěn)定狀態(tài)。由圖2可知，不同質(zhì)量比復(fù)合材料浸泡28 d后質(zhì)量均有所增加。大致規(guī)律是隨著nβ－TCP的增加，復(fù)合材料質(zhì)量先增大后減小，當(dāng)二者的質(zhì)量比為1∶1時(shí)，其質(zhì)量比浸泡前明顯增大，增重率達(dá)到4.45%。

圖1 SBF浸泡液的的pH值隨時(shí)間變化曲線Fig.1 Variation of pH value of SBF solution due to soaking time

不同質(zhì)量比復(fù)合材料降解28 d后的XRD及 FTIR測(cè)試結(jié)果見(jiàn)圖3及圖4，從圖3中可以看出:不同質(zhì)量比復(fù)合材料的物相組成沒(méi)有明顯變化，但與浸泡前復(fù)合材料的XRD圖譜比對(duì)，可觀察到類骨羥基磷灰石的弱衍射峰。從圖4中可以看到，550 cm－1和607 cm－1對(duì)應(yīng)P的υ4振動(dòng)吸收峰，961 cm－1對(duì)應(yīng)P的υ1振動(dòng)吸收峰;在1042 cm－1、1462 cm－1等附近出現(xiàn)的吸收峰對(duì)應(yīng)的是碳酸根(酯)基團(tuán)的吸收峰，它們是代替 P的C產(chǎn)生的振動(dòng)帶［8］。

圖2 N，O-CMC/n-β-TCP復(fù)合材料在SBF中浸泡28 d后的質(zhì)量變化Fig.2 Mass variation of N，O-CMC/n-β-TCP composites after soaked in SBF solution for 28 d

圖3 N，O-CMC/n-β-TCP復(fù)合材料在SBF中浸泡后的XRD圖譜Fig.3 XRD patterns of N，O-CMC/n-β-TCP com posites after soaked in SBF solution

圖4 N，O-CMC/n-β-TCP復(fù)合材料在模擬體液中浸泡后的FTIR圖譜Fig.4 FTIR spectra of N，O-CMC/n-β-TCP com posites after soaked in SBF solution

不同質(zhì)量比復(fù)合材料在SBF浸泡液中鈣、磷離子濃度隨時(shí)間變化如圖5所示，既材料浸入溶液中的第1周，溶液中的鈣、磷離子濃度下降較快;之后的2周，鈣離子濃度在此水平緩慢上升;第4周時(shí)，鈣離子濃度又緩慢下降。N，O－CMC/β－TCP質(zhì)量比為1∶2的磷離子濃度在此后的兩周持續(xù)呈小幅下降趨勢(shì)，至最后1周趨于平穩(wěn)，其他組磷離子濃度在此后的3周均在此水平小幅波動(dòng)并趨于平穩(wěn)。

圖5 復(fù)合材料浸泡不同時(shí)間后SBF溶液中Ca、P離子濃度變化Fig.5 Variation of Ca and Pelemental concentration of SBF solution due to soaking time

3 討論

3.1 SBF溶液pH值變化的分析

如果復(fù)合材料在模擬體液浸泡過(guò)程中發(fā)生降解，體液pH值就會(huì)出現(xiàn)相應(yīng)的變化。浸泡初期體液pH值急劇下降的原因可能是n－β－TCP和殼聚糖的降解與類骨磷灰石的生長(zhǎng)使體液中存在著大量的Ca2+、P和C離子，其中Ca2+離子沉積在試樣表面，使體液中剩余了大量的P和 C離子，因此模擬體液的pH值急劇下降。隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，體液的pH值逐漸回升，至第二周時(shí)基本處于穩(wěn)定;這可能是材料的降解速率與磷灰石的沉積速率由不平衡的波動(dòng)達(dá)到平衡的動(dòng)態(tài)變化過(guò)程，既磷灰石及殼聚糖的降解與類骨磷灰石的生長(zhǎng)在第二周時(shí)基本處于穩(wěn)定狀態(tài)，體液的pH值變化不大。實(shí)驗(yàn)中不同比例復(fù)合材料降解過(guò)程中pH值變化均較小且在近中性狀態(tài)，如:N，O－CMC/β－TCP質(zhì)量比為1∶2時(shí)，pH值處于6. 855～7.40;質(zhì)量比為2∶1時(shí)，pH值處于6.80～7.40，尤其是當(dāng)二者質(zhì)量比為1∶1時(shí)，pH值處于7.0～7.4，這樣的復(fù)合材料在植入生物體后應(yīng)有助于使周圍的pH值穩(wěn)定在中性偏堿的狀態(tài)，從而減少無(wú)菌性炎癥的發(fā)生，使材料的生物相容性得到提高。

3.2 浸泡后復(fù)合材料的質(zhì)量變化分析

不同質(zhì)量比復(fù)合材料在模擬體液中浸泡28 d后的質(zhì)量均增加，說(shuō)明溶液中的某些離子已沉積到復(fù)合材料中。XRD分析(見(jiàn)圖3)表明，復(fù)合材料表面有類骨磷灰石相生成，說(shuō)明復(fù)合材料質(zhì)量的增加是因?yàn)椴牧媳砻娉练e了類骨磷灰石。同時(shí)也表明，實(shí)驗(yàn)所制備的N，O－CMC/n－β－TCP復(fù)合材料具有良好的生物活性，具有誘導(dǎo)材料表面形成類骨磷灰石的潛能。

3.3 浸泡后復(fù)合材料的XRD分析

為了更好地研究復(fù)合材料在模擬體液中的降解情況，對(duì)降解28 d后的試樣進(jìn)行XRD表征結(jié)果顯示:不同質(zhì)量比復(fù)合材料的物相組成沒(méi)有明顯變化，但與各自材料浸泡前XRD圖譜對(duì)照，可觀察到類骨羥基磷灰石的弱衍射峰，并且由于類骨羥基磷灰石結(jié)晶較弱，從而使浸泡后復(fù)合材料的衍射峰略有寬化。其成因可能是在SBF溶液中，同時(shí)含有鈣、磷、碳酸根離子及其他微量元素;其中，鈣、磷離子自身具有成核作用，而溶液中的碳酸根離子和其它金屬離子也可沉積并進(jìn)入晶格中，從而形成碳酸化的羥基磷灰石結(jié)構(gòu)，即類骨羥基磷灰石。類骨磷灰石具有與骨磷灰石相似的組成和結(jié)構(gòu)，易被內(nèi)源性生長(zhǎng)因子，蛋白質(zhì)分子和骨組織細(xì)胞識(shí)別為骨礦物，進(jìn)而有利于新骨形成，是評(píng)價(jià)材料具有誘導(dǎo)成骨作用的要素［8］。

3.4 浸泡后復(fù)合材料的FTIR分析

XRD測(cè)試只能提供材料晶相變化信息，無(wú)法了解在整個(gè)復(fù)合材料的浸泡過(guò)程中某些離子或基團(tuán)是否發(fā)生變化，因此對(duì)降解后復(fù)合材料進(jìn)行FTIR測(cè)試十分必要。圖4中可以明顯看到由C替代P產(chǎn)生的振動(dòng)帶，這表明復(fù)合材料的降解產(chǎn)物不僅是單純的羥基磷灰石，而且是含有一定B型碳酸磷灰石的類骨型磷灰石(HCA)。HCA是人體骨組織的主要無(wú)機(jī)鹽，N，O－CMC/nβ－TCP復(fù)合材料表面在SBF中形成類骨的HCA微晶，說(shuō)明材料對(duì)生理環(huán)境具有響應(yīng)特性和生物活性，具有促進(jìn)新骨形成的功能［8］。

3.5 不同浸泡時(shí)間復(fù)合材料鈣、磷離子濃度變化分析

從圖5中可知，浸泡的第一周，由于SBF溶液中的鈣離子、磷酸根離子濃度較高，且溶液中還含有碳酸根等離子，這些離子在樣品表面快速形成類骨羥基磷灰石沉積物，消耗了大量鈣、磷離子，因而使SBF溶液中的鈣、磷離子濃度下降較快。隨著浸泡時(shí)間的延長(zhǎng)，溶液中鈣離子又在材料表面沉積，同時(shí)磷酸三鈣的降解使溶液中的鈣、磷離子增加，這種沉積與降解過(guò)程的不平衡導(dǎo)致浸泡液中的鈣、磷離子濃度波動(dòng)變化，并逐漸由不平衡達(dá)到動(dòng)態(tài)平衡，最終使溶液中的鈣、磷離子濃度基本保持恒定。其中N，O－CMC/n－β－TCP質(zhì)量比為1∶1的鈣、磷離子濃度波動(dòng)幅度較小，說(shuō)明該材料在SBF浸泡液中的降解與沉積趨勢(shì)較適宜，具有較好的力學(xué)支撐。

4 結(jié)束語(yǔ)

不同質(zhì)量比N，O－CMC/n－β－TCP復(fù)合材料在模擬體液中降解性能的檢測(cè)結(jié)果表明:不同質(zhì)量比復(fù)合材料降解液的pH值為6.9～7.4;材料的質(zhì)量隨降解時(shí)間呈增加趨勢(shì);材料表面均有類骨羥基磷灰石生成?？傊N比例復(fù)合材料在SBF中均有較好的降解性，尤以二者質(zhì)量比為1∶1時(shí)性能最好。但在生物體內(nèi)的性能是否如此，還需進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)證實(shí)。

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