王曉花，章建程，王艷軍，周宏元，徐靈活，胡家慶

近年來，隨著艦船武器裝備的發(fā)展，艦船噸位、航速以及動力裝置馬力的不斷提高，艦船噪聲污染日趨嚴重，成為艦艇艙室的主要環(huán)境有害因素。噪聲對艇員的影響日益受到關(guān)注，成為航海醫(yī)學(xué)研究的重要課題之一。研究證明，采用適宜參數(shù)的前噪聲暴露，可對其后強噪聲暴露引起的聽力損失產(chǎn)生保護作用[1]，可能機制為噪聲前暴露可減少其后強噪聲暴露引起的毛細胞缺失?；儺a(chǎn)物耳聲發(fā)射(DPOAE)檢測，具有頻率特性客觀、快速、無創(chuàng)等優(yōu)點，是聽力篩選及早期耳蝸功能改變檢測的有效方法。氧化損傷作為噪聲性聽覺損傷的主要機制之一已得到大量研究證實，本研究觀察強噪聲暴露后，不同聲環(huán)境條件下豚鼠DPOAE幅值的變化及總一氧化氮合酶(TNOS)活力，探討強噪聲暴露后不同聲環(huán)境對豚鼠噪聲性聽覺損傷恢復(fù)的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 30只雄性健康白化種紅目豚鼠(海軍醫(yī)學(xué)研究所實驗動物中心提供)，耳廓反應(yīng)靈敏，體重280～320g，鼠齡4個月。豚鼠飼養(yǎng)于海軍醫(yī)學(xué)研究所實驗動物中心，自由飲水攝食，飼養(yǎng)環(huán)境溫度22±3℃，環(huán)境噪聲＜50dB。

1.2 分組及噪聲暴露 豚鼠隨機均分為5組，每組6只：A組[110 decibels sound pressure level(dB SPL)白噪聲4h后繼續(xù)84dB SPL噪聲暴露4h]；B組(110dB SPL白噪聲4h后繼續(xù)84dB SPL噪聲暴露8h)；C組(110dB SPL白噪聲4h后繼續(xù)84dB SPL噪聲暴露24h)；D組(僅110dB SPL白噪聲4h)；E組(空白對照組，無噪聲暴露)。噪聲暴露在專門的噪聲暴露室內(nèi)進行，豚鼠單籠放置。聲源采用Sine Random Generator(型號1207，丹麥BK公司)，功率放大器采用Power amplifier(型號FJG500-1c)。暴露室中央和四角噪聲水平均勻(±1dB)。

1.3 DPOAE測試 DPOAE測試儀器為美國IHS系統(tǒng)，豚鼠用1%戊巴比妥鈉38mg/kg腹腔注射麻醉。A、B、C和D組豚鼠分別在噪聲暴露前1d進行第1次DPOAE測定，噪聲暴露停止后1d進行第2次DPOAE測定，噪聲暴露停止后7d進行第3次DPOAE測定；E組豚鼠在相應(yīng)時間點行DPOAE測試。測試參數(shù)設(shè)置：L1=L2=65dB SPL，f2/f1=1.22。DPOAE聽力圖取455、641、905、1281、1810、2563、3619、5121、7243共9個頻率點進行測試，數(shù)據(jù)分析以頻率f1為準。

1.4 血生化指標測定 豚鼠上述指標測試完畢后，即刻取血分離約0.5ml血漿樣品凍存。利用超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)和一氧化氮合酶(NOS)等相應(yīng)試劑盒測試SOD活力、MDA含量和NOS活力。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理 各組指標數(shù)據(jù)以Excel建庫，采用SPSS 13.0軟件進行統(tǒng)計分析，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

表1 噪聲暴露前1d 5組9個頻率點DPOAE幅值(±s, n=6)Tab.1 DPOAE amplitudes of 9 frequency points 1 day before noise exposure in 5 groups ±s, n=6)

表1 噪聲暴露前1d 5組9個頻率點DPOAE幅值(±s, n=6)Tab.1 DPOAE amplitudes of 9 frequency points 1 day before noise exposure in 5 groups ±s, n=6)

Group Frequency points(Hz)455 641 905 1281 1810 2563 3619 5121 7243 A 3.67±4.32 0.33±6.92 4.83±9.97 10.00±9.57 3.67±9.61 1.17±6.65 –4.83±5.83 3.00±10.26 16.17±15.55 B –5.00±6.40 –11.4±15.1 0.40±10.92 2.00±11.77 6.20±9.04 1.40±10.74 –2.60±12.50 6.80±14.29 20.40±8.79 C 2.50±6.09 4.17±5.19 8.17±8.98 6.67±12.16 1.50±11.95 –1.83±10.36 –5.83±12.11 6.83±12.54 22.00±9.67 D –4.67±10.7 0.00±10.79 4.17±5.19 7.17±14.55 2.50±11.78 –2.33±10.52 –2.17±9.60 5.16±13.82 20.17±14.80 E –2.50±7.61 –2.0±12.13 7.00±9.96 10.83±5.11 8.17±6.58 1.33±4.63 –3.00±8.83 5.83±11.94 25.17±6.65

2 結(jié) 果

2.1 噪聲暴露前1d各組豚鼠DPOAE幅值變化 噪聲暴露前1d，5組豚鼠9個頻率點的DPOAE幅值間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(表1)。

2.2 噪聲暴露后1d各組豚鼠DPOAE幅值變化 噪聲暴露后1d，與E組相比，D組1281、2563、3619、5121和7243Hz頻率點的DPOAE幅值降低(P＜0.05)，表明豚鼠聽力受損；C組與D組相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，表明84dB、24h噪聲環(huán)境對強噪聲暴露后的聽力損害無保護作用。與D組相比，A組1810Hz頻率點DPOAE幅值升高(P＜0.05)，而在其他頻率點，A組DPOAE幅值僅有升高趨勢，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義，表明A組中強噪聲暴露后的聲環(huán)境對聽力損失的恢復(fù)可能有一定的促進作用。與D組相比，B組1810、5121Hz頻率點DPOAE幅值升高(P＜0.05)，而在其他頻率點，B組DPOAE幅值僅有升高趨勢，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義，說明B組中強噪聲暴露后的聲環(huán)境對聽力損失的恢復(fù)也可能有一定促進作用(表2)。

2.3 噪聲暴露后7d各組豚鼠DPOAE幅值變化 噪聲暴露后7d，與E組相比，D組1281、1810Hz頻率點DPOAE幅值升高(P＜0.05)，5121、7243Hz頻率點DPOAE幅值降低(P＜0.05)，表明噪聲暴露7d后，低頻聽力有部分恢復(fù)，高頻聽力損失仍然存在。而C組與D組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，表明C組中強噪聲暴露后的聲環(huán)境無保護作用。與D組相比，A組5121Hz頻率點DPOAE幅值升高(P＜0.05)，而在641、1281、2563、3619、5121、7243Hz頻率點，DPOAE幅值僅有升高趨勢，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義。與D組相比，B組5121Hz頻率點DPOAE幅值升高(P＜0.05)，而在455、641、905、2563、3619、5121、7243Hz頻率點，DPOAE幅值僅有升高趨勢，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義，表明噪聲暴露7d后，A、B組中強噪聲暴露后的聲環(huán)境對豚鼠聽力損失尤其對高頻部分的聽力損失仍然有一定的保護作用(表3)。

表2 噪聲暴露后1d 5組9個頻率點的DPOAE幅值(±s, n=6)Tab.2 DPOAE amplitudes of 9 frequency points 1 day after noise exposure in 5 groups (±s, n=6)

表2 噪聲暴露后1d 5組9個頻率點的DPOAE幅值(±s, n=6)Tab.2 DPOAE amplitudes of 9 frequency points 1 day after noise exposure in 5 groups (±s, n=6)

(1)P＜0.05 compared with group E; (2)P＜0.05 compared with group D; (3)P＜0.05 compared with group C

Group Frequency points(Hz)455 641 905 1281 1810 2563 3619 5121 7243 A –3.50±7.58 –2.00±14.0 0.00±5.73 1.00±12.76 0.50±8.31(1)(2) –10.33±6.38(1) –14.50±8.78(1) –10.67±12.47(1) –2.17±18.62(1)B –2.33±7.92 –7.00±8.39 –4.67±5.89 –2.17±7.33 4.33±3.67(2)(3) –8.33±9.24 –12.67±1.86(1) –1.33±6.12(2)(3)–12.83±12.64 C –3.60±6.43 0.00±9.27 2.80±9.31(2) 0.80±9.55 –5.80±10.94(1) –11.8±5.45(1) –16.60±2.70(1) –16.00±10.63(1) –2.17±18.62(1)D –5.00±7.67 –9.5±15.71 –8.83±7.41 –9.00±7.32(1)–11.0±8.17 –12.17±5.91(1) –15.50±2.43(1) –18.00±7.95(1) –11.5±13.26(1)E –8.67±6.56 –6.83±8.91 –2.67±11.5 8.50±6.72 10.50±5.72 0.67±10.23 –0.17±10.40 8.50±16.35 23.17±8.70

2.4 各組豚鼠血漿SOD活力、MDA含量和NOS活力的測定 噪聲暴露后7d，與E組相比，A、B兩組SOD活力降低(P＜0.05)，MDA含量增加(P＜0.05)。與D組相比，A、B兩組MDA含量增加(P＜0.05)，C組TNOS活力降低(P＜0.05)。與C組相比，A、B兩組MDA含量增加(P＜0.05，表4)。

表3 噪聲暴露后7d各組9個頻率點的DPOAE幅值(±s, n=6)Tab.3 DPOAE amplitudes of 9 frequency points 7 days after noise exposure in 5 groups (±s, n=6)

表3 噪聲暴露后7d各組9個頻率點的DPOAE幅值(±s, n=6)Tab.3 DPOAE amplitudes of 9 frequency points 7 days after noise exposure in 5 groups (±s, n=6)

(1)P＜0.05 compared with group E; (2)P＜0.05 compared with group D

Group Frequency points(Hz)455 641 905 1281 1810 2563 3619 5121 7243 A –9.00±6.75 –5.83±4.31 1.17±3.87 16.50±10.35(1) 5.00±5.80 3.67±7.15 –1.33±6.62 7.50±5.72(2) 20.83±4.31 B –1.17±4.79 –4.33±9.37 2.83±11.7915.33±8.48(1) 6.83±10.46 2.67±7.45 –3.67±8.19 10.00±6.36(2) 22.50±3.51 C –3.5±10.25 0.33±8.66 5.50±11.8814.00±11.82 –0.83±11.28(2)–1.67±9.04 –9.83±10.30(1) 2.17±15.05 9.50±20.36(1)D –4.67±12.71 –7.33±6.41 2.50±10.2716.50±8.46(1) 11.33±10.91(1)–0.84±9.06 –5.00±6.78 –5.00±13.74(1)10.16±13.96(1)E –5.50±7.18 –6.17±9.91 –3.33±11.57 2.33±9.75 –0.50±4.68 6.67±2.42 1.67±7.81 11.00±7.95 25.17±12.47

表4 噪聲暴露后7d各組豚鼠SOD活力、MDA含量和NOS活力變化(x±s, n=6)Tab.4 Variance of the activity of SOD, TNOS and the content of MDA in five groups 7 days after noise exposure (±s, n=6)

表4 噪聲暴露后7d各組豚鼠SOD活力、MDA含量和NOS活力變化(x±s, n=6)Tab.4 Variance of the activity of SOD, TNOS and the content of MDA in five groups 7 days after noise exposure (±s, n=6)

(1)P＜0.05 compared with group E; (2)P＜0.05 compared with group D; (3)P＜0.05 compared with group C

TNOS activity(U/ml)A 99.65±20.96(1) 2.69±0.58(1)(2)(3) 39.03±2.12 B 97.15±36.96(1) 2.86±0.81(1)(2)(3) 41.31±4.45 C 115.36±7.18 1.83±0.43 38.08±1.01(2)D 112.30±14.13 1.09±0.41 42.05±2.85 E 128.17±10.65 1.52±0.83 40.49±1.85 Group SOD activity(U/ml)MDA content(nmol/ml)

3 討 論

DPOAE是由固定頻率比和強度差的兩個純音fl、f2誘發(fā)耳蝸產(chǎn)生，在基底膜上，f1和f2的特性頻率定位區(qū)之間會產(chǎn)生一系列調(diào)制聲，f1－f2處DPOAE起源于基底膜上兩個原始音f1、f2之間，此處幅值最大[2]。Rosanowski等[3]研究證明，中等強度噪聲或外傷首先損傷外毛細胞，內(nèi)毛細胞、支持細胞只在劇烈或長期損傷時才受累，而內(nèi)毛細胞主要司聲音傳導(dǎo)，外毛細胞主要與聽敏度有關(guān)[4]。因此純音測聽、聽覺腦干反應(yīng)(ABR)等檢測聲音傳導(dǎo)的方法在損傷初始階段結(jié)果正常，而耳聲發(fā)射反映外毛細胞功能狀態(tài)，可以表現(xiàn)為相應(yīng)頻率的異常，因而DPOAE被認為是一個檢測早期聽力損失的敏感指標。

近年來有研究表明，強噪聲暴露后，與隔絕噪聲環(huán)境相比，低強度噪聲刺激對噪聲性聽覺損傷有保護作用，可能機制為強噪聲暴露后，低強度噪聲環(huán)境對聽神經(jīng)纖維軸突和毛細胞靜纖毛的再生、耳蝸微循環(huán)的改善、神經(jīng)生長因子的釋放及耳蝸抗氧化能力的提高，有一定促進作用[5-6]。本研究結(jié)果顯示，強噪聲暴露后，84dB、4h和84dB、8h的聲環(huán)境對強噪聲暴露所致的聽力損失恢復(fù)有一定促進作用，暴露后7d，保護作用仍然存在，尤其是高頻聽力損失；84dB、24h的噪聲環(huán)境對強噪聲暴露所致的聽力損失沒有保護作用。

研究顯示，噪聲刺激會影響耳蝸局部組織的有氧代謝，引起能量代謝超負荷、ATP耗竭，并產(chǎn)生氧自由基，從而對耳蝸產(chǎn)生毒性作用[7]。氧自由基生成增加的同時，會激活機體的防護體系，使抗氧化物質(zhì)增多[8]。NOS在耳蝸局部和聽覺系統(tǒng)低級中樞核團均有分布[9]。噪聲刺激后，耳蝸內(nèi)血管收縮，血流減慢，局部低氧分壓、缺血會誘導(dǎo)NOS mRNA表達增強，產(chǎn)生具有直接細胞毒性的較高濃度的NO[10]。本研究擬從氧自由基反應(yīng)及NO損傷的角度，探討這一現(xiàn)象發(fā)生的機制，但結(jié)果并未證實其相關(guān)性，具體機制有待于進一步研究。

本實驗中，我們觀察到強噪聲暴露后再處于中等水平噪聲條件下，過氧化反應(yīng)損傷仍在進行，過氧化產(chǎn)物的產(chǎn)生超過了機體的清除能力，抗氧化能力在噪聲暴露早期代償性升高后又出現(xiàn)降低。本實驗中血漿TNOS無明顯變化，可能是因為耳蝸是噪聲直接作用的特異性靶器官，噪聲暴露后起主要作用的是豚鼠耳蝸NOS神經(jīng)元及其活力，血漿中TNOS的變化不顯著[11]。

綜上所述，本研究初步明確了強噪聲暴露后不同持續(xù)時間中等水平噪聲暴露對豚鼠聽力的保護作用，研究結(jié)果可能對制定新的噪聲防護綜合措施具有一定的參考價值。

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