劉莉，譚波濤，李昱，余剛

神經(jīng)元通過線粒體氧化磷酸化生成ATP來提供能量，線粒體不是靜止的細(xì)胞器，波動的內(nèi)環(huán)境和增加的內(nèi)生活性氧都會導(dǎo)致線粒體損傷，因此對細(xì)胞內(nèi)代謝物、活性氧流通、線粒體功能和數(shù)量進(jìn)行動態(tài)調(diào)節(jié)非常重要[1]。腦缺血過程中很多機制都會引起神經(jīng)元線粒體功能障礙[2]。細(xì)胞內(nèi)充足的線粒體數(shù)量及活躍的線粒體DNA(mtDNA)的復(fù)制和合成可改變病理狀態(tài)下活性氧的增加[3-4]。線粒體轉(zhuǎn)錄因子A(mitochondrial transcription factor A，TFAM)是一種維持線粒體DNA復(fù)制量的核編碼蛋白[3]，是反映線粒體生物合成的重要因子[4]。研究證實，小鼠TFAM基因損傷可導(dǎo)致mtDNA損耗，影響mtDNA轉(zhuǎn)錄及其所編碼多肽的合成，造成嚴(yán)重的呼吸鏈功能障礙[5]。解偶聯(lián)蛋白2(UCP2)是一種跨線粒體內(nèi)膜的質(zhì)子通道轉(zhuǎn)運蛋白[6]，具有抑制線粒體活性氧生成[7]、降低線粒體電勢差[8]、限制線粒體內(nèi)Ca2+負(fù)荷[5]等作用，最終通過抑制細(xì)胞凋亡發(fā)揮保護(hù)效應(yīng)。姜黃素是從姜黃根莖中提取的一種酚類物質(zhì)，具有潛在的抗炎[9]、抗氧化[10]、抗腫瘤[11-12]等生物學(xué)效應(yīng)[8]。已有研究表明，姜黃素對大鼠大腦局灶性缺血再灌注損傷具有保護(hù)作用[13]，但其機制一直存在爭議，尤其是姜黃素對線粒體的影響鮮有報道。本研究擬通過觀察不同劑量姜黃素預(yù)處理對大鼠大腦皮質(zhì)UCP2和TFAM表達(dá)的影響，探討其對腦缺血再灌注損傷的保護(hù)機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及試劑 健康雄性SD大鼠80只，體重220～300g，由大坪醫(yī)院實驗動物中心提供。姜黃素(C1386，美國Sigma)用二甲基亞砜(DMSO)為溶劑配制為50mg/ml和100mg/ml兩個工作濃度。

1.2 動物分組及處理 將大鼠隨機均分為假手術(shù)組，缺血再灌注(I/R)組，姜黃素高劑量、低劑量組(簡稱高、低劑量組)，每組20只。高、低劑量組于缺血前5d連續(xù)每天(最后一次于缺血前30min給藥)分別經(jīng)腹腔注射姜黃素100mg/kg和50mg/kg，假手術(shù)組和I/R組注射等體積DMSO。參照Longa等[14]的線栓改良法復(fù)制大鼠右側(cè)大腦局灶性腦缺血模型，將一直徑0.234mm的漁線經(jīng)右側(cè)頸外動脈切口緩慢向頸內(nèi)動脈入顱方向推進(jìn)18～20mm，感到阻力時即阻斷大腦中動脈，2h后撥出魚線完成造模。假手術(shù)組僅分離暴露頸總、頸外及頸內(nèi)動脈，不予線栓插入。術(shù)后按照Longa 5分法[14]行神經(jīng)癥狀評分，癥狀不明顯(評分＜1分)的動物予以剔除。

1.3 腦組織固定及尼氏染色 再灌注24h后，麻醉動物，打開胸腔，暴露心臟，將一輸液針頭插入左心室，向主動脈方向灌入生理鹽水，同時于右心耳處剪一小口，灌注至右心房流出清亮液體，再由左心室灌入約200ml 4%多聚甲醛磷酸緩沖液固定。斷頭取腦，放入4%多聚甲醛溶液中固定過夜。在距右側(cè)額葉前端3mm處向后(此為大腦中動脈供血的皮質(zhì)區(qū))切成厚3～4mm的薄片，依次放入梯度乙醇中脫水，二甲苯透明，包埋，切片。腦組織切片脫蠟后用蒸餾水沖洗，1%甲苯胺藍(lán)溶液室溫浸染30min；蒸餾水中沖洗后乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固。

1.4 電鏡標(biāo)本制備 灌注固定腦組織：所用灌注液為2%多聚甲醛與2%戊二醛的混合液，余步驟同前所述腦組織固定方法。在距額葉前端3mm和7mm處行冠狀切片，取中間4mm厚腦塊，沿矢狀縫線旁開4mm處，與矢狀縫所在面呈30°斜切，外側(cè)皮質(zhì)為缺血核心區(qū)。每例在內(nèi)側(cè)2mm以內(nèi)取材3塊，每塊1mm3，于4%戊二醛中固定。按常規(guī)操作進(jìn)行電鏡標(biāo)本制備，透射電鏡觀察神經(jīng)元內(nèi)線粒體的變化。

1.5 免疫組化染色 按照SP試劑盒說明書(北京康為世紀(jì)有限公司)進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，所用抗體為兔抗大鼠UCP2多克隆抗體(1:200，博奧森公司)和兔抗大鼠TFAM單克隆抗體(1:100，美國Biovision)。光鏡下胞質(zhì)中棕黃色顆粒為陽性產(chǎn)物。應(yīng)用Image Pro Plus 6.0(Media Cybernetics，美國)圖像分析系統(tǒng)測定免疫陽性產(chǎn)物的平均光密度值。

1.6 TFAM和UCP2 mRNA表達(dá)測定 按照RNAiso Plus試劑盒(D9108A，日本TaKaRa)說明書提取皮質(zhì)總RNA，引物由上海生工生物工程公司合成。引物序列：UCP2上游引物5'-GGTCGGAGATACCAGAGCAC-3'，下游引物5'-ATGAGGTTGGCTTTCAGGAG-3'，產(chǎn)物長度173bp；TFAM上游引物5'-ACGCCTAAAGAAGAAAGCACA-3'，下游引物5'-ACACTGCGACGGATGAGAT-3'，產(chǎn)物長度297bp；GAPDH上游引物5'-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3'，下游引物5'-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3'，產(chǎn)物長度452bp。用一步法RT-PCR試劑盒(DRR037A，日本TaKaRa)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄和PCR擴增，擴增產(chǎn)物行瓊脂糖凝膠電泳，紫外分光光度計掃描，以GAPDH基因作為內(nèi)參照，以UCP2和TFAM與GAPDH擴增條帶光密度的比值表示UCP2和TFAM mRNA表達(dá)水平。

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 17.0軟件行統(tǒng)計學(xué)分析。計量資料以x±s表示，組間比較采用單因素方差分析，對多個樣本均數(shù)間的兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

圖1 姜黃素對皮質(zhì)梗死區(qū)神經(jīng)元尼氏體丟失的影響(尼氏染色 ×400)Fig. 1 Effect of curcumin on loss of Nissl body in infarcted cortex (Nissl staining ×400)A. Sham group; B. I/R group; C. Curcumin 50mg/kg group; D. Curcumin 100mg/kg group

圖2 姜黃素對皮質(zhì)梗死區(qū)神經(jīng)元線粒體形態(tài)的影響(透射電鏡 ×5000 )Fig. 2 Effect of curcumin on mitochondrial morphology of neuron in infarcted cortex (transmission electron microscope ×5000)A. Sham group; B. I/R group; C. Curcumin 50mg/kg group; D. Curcumin 100mg/kg group

2 結(jié) 果

2.1 姜黃素對皮質(zhì)梗死區(qū)神經(jīng)元損傷的影響 在皮質(zhì)缺血受累區(qū)域周圍，I/R組染色后可見明顯細(xì)胞水腫、空泡變性，尼氏小體顏色變淺且數(shù)目變少，甚至溶解消失。姜黃素高、低劑量組的神經(jīng)元胞核清晰，尼氏小體深染成紫藍(lán)色，核周圍顆粒大，呈塊狀或顆粒狀，高劑量組損傷程度比低劑量組輕(圖1)。

2.2 姜黃素對皮質(zhì)梗死區(qū)神經(jīng)元線粒體形態(tài)的影響 假手術(shù)組大腦中動脈供血皮質(zhì)區(qū)域內(nèi)，線粒體大小、形態(tài)較一致，分布較均勻，線粒體嵴的排列規(guī)則有序。缺血再灌注損傷后，線粒體腫脹明顯，嵴紊亂、短小，甚至斷裂溶解。姜黃素預(yù)處理減輕了缺血再灌注對線粒體的損傷，線粒體嵴的減少較I/R組輕(圖2)。

2.3 姜黃素對皮質(zhì)梗死區(qū)UCP2和TFAM蛋白表達(dá)的影響 免疫組化染色顯示，假手術(shù)組、I/R組、低劑量組和高劑量組的UCP2蛋白光密度值分別為0.01576±0.00021、0.00333±0.00016、0.00880±0.00032、0.01267±0.00018，TFAM蛋白光密度值分別為0.00642±0.00047、0.00215±0.00027、0.00237±0.00029、0.00295±0.00023。

由圖3可見，假手術(shù)組中由右側(cè)大腦中動脈供血的皮質(zhì)區(qū)神經(jīng)元內(nèi)UCP2陽性產(chǎn)物表達(dá)豐富，呈深棕色，而I/R組中UCP2的表達(dá)顯著下降(P＜0.05)，細(xì)胞形態(tài)也發(fā)生了變化。在相應(yīng)區(qū)域內(nèi)，高、低劑量組神經(jīng)元內(nèi)UCP2的表達(dá)較I/R組明顯增多(P＜0.05)，且以高劑量組更為顯著(P＜0.05)。假手術(shù)組中相應(yīng)皮質(zhì)區(qū)可見大量TFAM陽性產(chǎn)物，缺血再灌注后TFAM表達(dá)下降(P＜0.05)。與I/R組相比，高劑量組TFAM陽性表達(dá)顯著增加(P＜0.05)，但低劑量組的表達(dá)量未見明顯增加。

2.4 姜黃素對皮質(zhì)梗死區(qū)UCP2和TFAM mRNA表達(dá)的影響 假手術(shù)組、缺血再灌注組、低劑量組和高劑量組的UCP2 mRNA相對表達(dá)量分別為0.14288±0.01445、0.10488±0.00564、0.16268±0.00990、0.21475±0.01401，TFAM mRNA相對表達(dá)量分別為0.40364±0.01607、0.18951±0.01176、0.20870±0.01902、0.29472±0.02307。

由圖4可見，與假手術(shù)組比較，I/R組由大腦中動脈供血的皮質(zhì)區(qū)中UCP2和TFAM mRNA表達(dá)顯著降低(P＜0.05)。高、低劑量組UCP2 mRNA表達(dá)水平均高于I/R組(P＜0.05)，且高劑量組升高更明顯(P＜0.05)；但TFAM mRNA僅在高劑量組中較I/R組增高(P＜0.05)，低劑量組與I/R組比較無顯著差異。

圖3 姜黃素對皮質(zhì)梗死區(qū)UCP2和TFAM表達(dá)的影響(SP ×400)Fig. 3 Effect of curcumin on the expressions of UCP2 and TFAM in infarcted cortex (SP ×400)

圖4 姜黃素對皮質(zhì)梗死區(qū)UCP2和TFAM的mRNA表達(dá)水平的影響Fig. 4 Effect of curcumin on the expression of mRNA of UCP2 and TFAM in infarcted cortex M. Marker; 1. Sham group; 2. I/R group; 3. Curcumin 50mg/kg group; 4. Curcumin 100mg/kg group

3 討 論

姜黃素是從植物姜黃根莖中提取的一種可食用的多元酚，研究已證實其對腦血管疾病、神經(jīng)中毒性疾病以及阿爾茨海默病、帕金森病、亨廷頓舞蹈癥等多種神經(jīng)變性疾病均有治療效果[14]，本實驗旨在探討其對急性缺血性腦損傷的保護(hù)機制。Yang等[15]認(rèn)為姜黃素在腦缺血再灌注損傷后通過上調(diào)抗氧化基因上游因子Nrf2發(fā)揮保護(hù)作用。Nrf2可進(jìn)一步促進(jìn)HO-1轉(zhuǎn)錄。HO-1是二期酶(phase Ⅱ enzymes)中的一種，可誘導(dǎo)血紅素降解，生成強效抗氧化分子膽紅素[15]，可與其他幾種二期酶(如谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶和NADPH)一起在體內(nèi)形成強大的氧化應(yīng)激防御系統(tǒng)。此外有研究認(rèn)為，姜黃素可通過增加保護(hù)性蛋白Bcl-2表達(dá)，抑制下游分子細(xì)胞色素C的釋放及Caspase3的活化，從而抑制細(xì)胞凋亡[16-17]。除了抗氧化效應(yīng)，還有部分學(xué)者認(rèn)為姜黃素可通過降低缺血再灌注后NF-κB和ICAM-1的表達(dá)減輕炎癥反應(yīng)，從而減輕腦損傷[18]。本實驗也觀察到姜黃素預(yù)處理明顯減輕了皮質(zhì)梗死區(qū)神經(jīng)元的損傷，證實了既往研究提出的姜黃素對缺血再灌注腦損傷有保護(hù)作用這一結(jié)論[13]。

本研究還觀察到姜黃素對神經(jīng)元亞細(xì)胞器存在一定影響，如再灌注后腫脹的線粒體內(nèi)嵴排列紊亂、變短甚至溶解，而一定劑量姜黃素預(yù)處理可減輕缺血再灌注對線粒體的損傷。線粒體嵴的數(shù)量與細(xì)胞呼吸功能有關(guān)，姜黃素可能通過保護(hù)神經(jīng)元線粒體來抵抗缺血所致的呼吸功能下降，從而保護(hù)神經(jīng)元。另外，本研究還發(fā)現(xiàn)姜黃素能上調(diào)與線粒體關(guān)系密切的UCP2和TFAM蛋白的表達(dá)，并且與劑量相關(guān)，提示UCP2和TFAM可能是姜黃素發(fā)揮腦保護(hù)效應(yīng)的靶點。

UCP2是UCP家族中在大腦有廣泛分布的蛋白之一，是一種線粒體內(nèi)膜蛋白，主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)。有學(xué)者認(rèn)為UCP2對腦缺血性損傷的保護(hù)作用與前炎癥因子的抑制和細(xì)胞保護(hù)因子的激活有關(guān)[19]。UCP2過表達(dá)能在一定程度上抵消缺血誘導(dǎo)的IL-6增加和Bcl-2減少[20]，還能增加細(xì)胞周期基因以及p-AKT、PKC和MEK蛋白的表達(dá)[19]。除此以外，UCP2還可能通過其他途徑來

改善缺血性腦損傷。既然UCP2是一種線粒體內(nèi)膜蛋白，我們有理由推測它可能通過改善線粒體功能而發(fā)揮保護(hù)效應(yīng)。UCP2蛋白本身具有抑制線粒體活性氧生成[6]、降低線粒體電勢差[10]、限制線粒體內(nèi)Ca2+負(fù)荷[5]等作用。Andrews等[21]還報道胃促生長素可增加野生型小鼠含神經(jīng)肽Y的神經(jīng)元核周體內(nèi)的線粒體數(shù)量，而UCP2基因敲除小鼠的線粒體數(shù)量沒有增加，提示UCP2很可能有另一種鮮為人知的功能，即調(diào)控線粒體生物合成。

TFAM是反映線粒體生物合成功能的一個重要指標(biāo)[22-23]，其對缺血性損傷的保護(hù)作用已有學(xué)者報道，如Ikeuchi等[24]認(rèn)為心肌缺血后過表達(dá)的TFAM可抑制mtDNA拷貝數(shù)的減少，維持線粒體呼吸鏈功能，從而抵抗心肌氧化應(yīng)激損傷。類似的保護(hù)作用在腦缺血中也有報道，如Hokari等[4]發(fā)現(xiàn)野生型小鼠在腦缺血再灌注后出現(xiàn)大量受損神經(jīng)元，細(xì)胞呈三角形，核周質(zhì)固縮，并伴隨神經(jīng)纖維空泡變性，而TFAM超表達(dá)的轉(zhuǎn)基因小鼠腦內(nèi)的這種受損神經(jīng)元明顯減少。本實驗結(jié)果顯示，姜黃素預(yù)處理明顯增加了大鼠皮質(zhì)梗死區(qū)TFAM陽性產(chǎn)物的表達(dá)，且與神經(jīng)元尼氏體丟失位于相同區(qū)域，提示TFAM的增加可能對缺血再灌注腦損傷起到了保護(hù)作用。

綜上，UCP2與TFAM之間可能存在一定的相互調(diào)節(jié)關(guān)系，且本研究顯示UCP2蛋白與TFAM蛋白在各處理組中的變化趨勢一致，也證實了這一點，但具體機制尚需進(jìn)一步研究證實。

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