王銘洋，趙 陽，張圣婷，陳學(xué)群，杜繼曾

（浙江大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)系神經(jīng)生物學(xué)和生理學(xué)研究室，浙江杭州310058）

低氧是激活p53的重要因素之一，p53也是機(jī)體應(yīng)對(duì)低氧應(yīng)激的重要調(diào)節(jié)因子。作為轉(zhuǎn)錄因子，p53的主要功能是調(diào)節(jié)細(xì)胞周期停滯和細(xì)胞凋亡的相關(guān)靶基因，兩類靶基因之間的表達(dá)平衡決定細(xì)胞命運(yùn)，與細(xì)胞周期停滯相關(guān)的p53靶基因包括p21，cyclinB2，F(xiàn)as／APO1等，與細(xì)胞凋亡相關(guān)的p53靶基因有bax，IGFBP3，Bcl-2等［1］。研究低氧應(yīng)激下 p53及其靶基因的表達(dá)變化模式與規(guī)律，對(duì)理解機(jī)體的低氧適應(yīng)性有重要意義。

小哺乳動(dòng)物根田鼠（Microtus oeconomus）和高原鼢鼠（Myospalax baileyi）是生活在我國青藏高原的優(yōu)勢物種，在長期進(jìn)化中形成了對(duì)高原低氧環(huán)境的良好適應(yīng)。目前沒有文獻(xiàn)報(bào)道高原鼢鼠和根田鼠肝臟p53的表達(dá)情況，我們實(shí)驗(yàn)室克隆了根田鼠（JX998171）和高原鼢鼠（JX998170）p53基因的編碼區(qū)序列，本研究比較了兩種高原動(dòng)物p53表達(dá)情況；探討了大鼠肝臟p53及其靶基因的表達(dá)模式。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物和低氧處理

高原動(dòng)物：成年健康的高原鼢鼠（體重250～300 g）和根田鼠（體重18～25 g）捕獲于中國科學(xué)院海北高寒草甸生態(tài)系統(tǒng)實(shí)驗(yàn)站附近（37°39’N，101°19’E，海拔：3.352 km，氣壓：508 mmHg）。隨機(jī)分為對(duì)照組和低氧組（n＝6），對(duì)照組置于海北實(shí)驗(yàn)站中（3.2 km），低氧組用含 8.0%O2和 92.0%N2的混合氣體模擬7 km低氧6 h。

平原動(dòng)物：采用健康雄性、清潔級(jí)SD大鼠，體重（170±20）g，購于浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心（SCXK2008-0033）。隨機(jī)分為對(duì)照組和三個(gè)低氧組（n＝6）：低氧組分別模擬 2 km（16.0%O2），5 km（10.8%O2）和 7 km（8.0%O2）低氧8 h，對(duì)照組不給予低氧處理。

1.2 樣品準(zhǔn)備和方法

低氧處理后，動(dòng)物被迅速斷頭犧牲，解剖獲取肝臟后迅速置于液氮中冷凍，隨后保存于-80℃。稱取約50mg肝臟進(jìn)行以下處理：（1）Q-PCR樣品：使用東盛公司RNA提取試劑盒提取肝臟組織總RNA，并采用TransScriptTMFirst-Strand cDNA Synthesis Super-Mix（TransGenBiotech，AT301）逆轉(zhuǎn)錄為 cDNA，置于-20℃保存。（2）Western-blot樣品：將肝臟組織置于RIPA裂解液（碧云天，P0013B）中，并按 1∶100的比例加入 PMSF（碧云天，ST505）和 protease inhibitor cocktail（Biomol，BML-KI103-0001）蛋白酶抑制劑，充分勻漿后，4℃，10 000×g，30 min離心，取上清。用BCA蛋白濃度測定試劑盒（碧云天，P0012）測定總蛋白濃度，并用上樣緩沖液調(diào)整蛋白濃度至40μg總蛋白／20μl緩沖液。

1.3 Quantitative Real Time PCR

按說明書要求制備Q-PCR反應(yīng)體系（SYBR?Premix Ex TaqTM，Takara），使用PRISM 7900HT實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)（Applied Biosystems）進(jìn)行試驗(yàn)和分析。以18s rRNA作為內(nèi)參基因。經(jīng)預(yù)實(shí)驗(yàn)，PCR產(chǎn)物電泳條帶清晰，無雜帶，溶解曲線較好。

1.4 W estern blot檢測

每個(gè)孔中加入20μl樣品，進(jìn)行SDS-PAGE（分離膠10%，濃縮膠5%）。按標(biāo)準(zhǔn)程序，轉(zhuǎn)膜后用含5%的脫脂奶粉TBST封閉。加一抗（p53mousemAb，cell signaling）室溫孵育2 h，一抗稀釋倍數(shù)如下：高原鼢鼠樣品1∶800，根田鼠樣品1∶800（5%的脫脂奶粉的 TBS-T稀釋），大鼠樣品 1∶2 000（calbiochem，signalBoostTMimmunoreaction enhancer kit solution1）。用TBS-T漂洗，再加入二抗（山羊抗小鼠lgG），稀釋倍數(shù)均為1∶2 000。室溫孵育1 h后，用TBS-T漂洗。經(jīng)ECL顯影后，高原鼢鼠、根田鼠和大鼠p53蛋白條帶單一，分子量正確。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)用均數(shù) ±標(biāo)準(zhǔn)誤（ˉx±Sx）表示，用 SPSS 15.0軟件分析，兩組間比較采用t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 低氧對(duì)高原鼢鼠、根田鼠和大鼠肝臟p53 mRNA表達(dá)的調(diào)節(jié)

低氧6 h（8.0%O2）顯著減少高原鼢鼠肝臟p53mRNA表達(dá)（P＜0.05），而使根田鼠肝臟 p53 mRNA表達(dá)呈下降趨勢（P＞0.05，圖 1A）。低氧 8 h（16.0%O2）沒有改變大鼠肝臟p53 mRNA表達(dá)，而嚴(yán)重低氧 8 h（10.8% 和 8.0%O2）顯著增加大鼠肝臟 p53mRNA表達(dá)（P＜0.05，P＜0.01，圖 1B）。

2.2 低氧對(duì)高原鼢鼠、根田鼠和大鼠肝臟p53蛋白表達(dá)的調(diào)節(jié)

低氧6 h（8.0%O2）顯著減少高原鼢鼠和根田鼠肝臟的p53蛋白表達(dá)（P＜0.01，圖 2A）；低氧 8 h（16.0%O2）沒有改變 p53蛋白表達(dá)，而嚴(yán)重低氧8 h（10.8%和8.0%O2）顯著增加 p53蛋白表達(dá)（P＜0.05，P＜0.01）。

Fig.1 Effects of hypoxia on hepatic p53mRNA expression in M.baileyi，M.oeconomus and rat，relative amountof p53mRNA evaluated by the ratio of p53 to 18s（±sx，n＝5，6）

Fig.2 Effects of hypoxia on heaptic p53 protein expression in M.baileyi，M.oeconomus and rat，relative amountof p53 protein evaluated by the ratio of band optical density（±sx，n＝5，6）

2.3 低氧對(duì)大鼠肝臟p53靶基因mRNA表達(dá)的調(diào)節(jié)

低氧8 h（16%O2）對(duì)大鼠肝臟凋亡靶基因bax和IGFBP3 mRNA表達(dá)沒有影響；低氧8 h（10.8%O2）顯著減少大鼠肝臟baxmRNA表達(dá)（P＜0.01），而IGFBP3mRNA表達(dá)呈下降趨勢；低氧 8 h（8.0%O2）相對(duì)于 10.8%低氧 8 h顯著減少 IGFBP3mRNA表達(dá)（P＜0.01），而 baxmRNA表達(dá)呈下降趨勢（P＞0.05）；不同程度的低氧對(duì)Bcl-2 mRNA的表達(dá)均無顯著影響（圖 3A）；低氧 8 h（10.8%和 8.0%O2）顯著增加 p21 mRNA表達(dá)（P＜0.01），但不同程度的低氧對(duì)大鼠肝臟cyclinB2 mRNA表達(dá)均無影響（圖3 B）。

Fig.3 Effects of hypoxia on hepatic p53 downstream genesmRNA expression in rat，relative amountof p53 targetgenes evaluated by the ratio of p53 target genes toβ-actin（±sx，n＝6）IGFBP3：Insulin-like growth factor binding protein 3；Bcl-2：B-cell lymphoma 2

3 討論

低氧通常被認(rèn)為能夠促進(jìn) p53表達(dá)，A.Sermeus和 C.Michiel提出p53的表達(dá)水平與低氧程度相關(guān)，常氧時(shí)保持低濃度，輕度低氧依舊保持低濃度甚至?xí)?，而中度低氧和重度低氧時(shí)濃度顯著升高［2］。我們發(fā)現(xiàn)，低氧（8.0%O2）處理6 h后，高原動(dòng)物根田鼠、高原鼢鼠肝臟中p53 mRNA和蛋白表達(dá)水平均顯著下降，而低氧（8.0%O2）處理8 h后，大鼠p53mRNA和蛋白表達(dá)則顯著上升。平原動(dòng)物和高原動(dòng)物的這種差異可能是不同的調(diào)節(jié)機(jī)制，Coose JP等發(fā)現(xiàn)1%低氧16 h可以增加MCF-7（人乳腺癌細(xì)胞）細(xì)胞p53蛋白表達(dá)，但使HepG2細(xì)胞 p53蛋白減少［3］，而 Pan Y等發(fā)現(xiàn) HCT116（人結(jié)腸癌細(xì)胞）細(xì)胞在0.2%低氧過夜培養(yǎng)后，高濃度組（低氧處理前濃度為 3×105cells／60 mm）的細(xì)胞培養(yǎng)液 pH低于6.9，p53升高，低濃度組（低氧處理前濃度為 5×104cells／60 mm）細(xì)胞培養(yǎng)液pH不變，p53沒有變化［4］。這些文獻(xiàn)說明低氧是否誘導(dǎo)p53表達(dá)不僅與低氧程度，還與細(xì)胞類型、微環(huán)境均相關(guān)。根田鼠和高原鼢鼠長期生活在海拔3～5 km的高寒草甸，一方面，其低氧耐受性更強(qiáng)，面對(duì)一定程度的低氧，p53表達(dá)的下降可能對(duì)其生存是有利的，可能不易造成細(xì)胞凋亡；另一方面，低氧下重要的HIF-1α轉(zhuǎn)錄因子可能參與對(duì)p53的調(diào)節(jié)，Seok GL等發(fā)現(xiàn)HIF-1α的過表達(dá)可以抑制人p53蛋白的表達(dá)，我們實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)發(fā)現(xiàn)低氧（8.0%O2，6 h）可以顯著增加高原鼢鼠HIF-1α蛋白的表達(dá)，而低氧也可以增加根田鼠HIF-1α蛋白［5］，所以高原動(dòng)物p53表達(dá)的下降可能和低氧誘導(dǎo)的 HIF-1α升高相關(guān)。平原動(dòng)物大鼠在低氧（8.0%O2）處理8 h后，肝臟p53基因和蛋白明顯上調(diào)，Iswar Baitharu等發(fā)現(xiàn)7.6 km低氧7 d能顯著增加大鼠大腦海馬區(qū)p53蛋白的表達(dá)，國內(nèi)也有文獻(xiàn)報(bào)道間歇低氧（10%O2，8 h／d）能促進(jìn)大鼠肺p53蛋白的表達(dá)。低氧時(shí)，平原動(dòng)物大鼠p53的增加則有利于選擇性激活或抑制p53下游的各類靶基因，保護(hù)正常細(xì)胞。

平原動(dòng)物大鼠在低氧（10.8%和 8.0%O2）處理 8 h后，肝臟p53 mRNA和蛋白表達(dá)顯著上升，但p53下游與細(xì)胞凋亡相關(guān)的靶基因bax和IGFBP3的表達(dá)均顯著下降，而與細(xì)胞周期停滯相關(guān)的靶基因p21的表達(dá)則顯著上升。有研究報(bào)道大鼠血清IGFBP3蛋白隨著間歇低氧程度（6% ～8%O2，8 s／each，6～24 times／1 h）的增加而下降。低氧上調(diào) p53細(xì)胞周期停滯靶基因，而下調(diào)p53細(xì)胞凋亡靶基因，反映機(jī)體適應(yīng)低氧的一種策略，缺氧時(shí)機(jī)體正常代謝受阻，細(xì)胞損傷的威脅加劇，為避免細(xì)胞遭到損傷，節(jié)省能量消耗，激活細(xì)胞周期停滯靶基因可以保護(hù)正常細(xì)胞，而細(xì)胞凋亡靶基因的抑制也起到保護(hù)正常細(xì)胞的作用。

總之，低氧對(duì)高原動(dòng)物和平原動(dòng)物p53表達(dá)的影響是不同的，低氧下調(diào)高原動(dòng)物p53基因和蛋白的表達(dá)，而上調(diào)平原動(dòng)物p53基因和蛋白的表達(dá)；平原動(dòng)物低氧后上調(diào)細(xì)胞周期停滯靶基因的表達(dá)，同時(shí)下調(diào)細(xì)胞凋亡靶基因的表達(dá)。以上結(jié)果，反映不同動(dòng)物肝臟p53及其靶基因低氧反應(yīng)性的不同，提示高原動(dòng)物和平原動(dòng)物肝細(xì)胞p53及其靶基因在低氧應(yīng)激時(shí)具有不同的表達(dá)模式。

［1］ Zhao Y，Chen X Q，Du JZ.Cellular adaptation to hypoxia and p53 transcription regulation［J］.J Zhejiang Univ Sci B，2009，10（5）：404-410.

［2］ Sermeus A，Michiels C.Reciprocal influence of the p53 and the hypoxic pathways［J］.Cell Death Dis，2011，2：e164.

［3］ Cosse JP，Sermeus A，Vannuvel Ketal.Differential effects of hypoxia on etoposide-induced apoptosis according to the cancer cell lines［J］.Mol Cancer，2007，6：61.

［4］ Pan Y，Oprysko PR，Asham A Met al.p53 cannot be induced by hypoxia alone but responds to the hypoxicmicroenvironment［J］.Oncogene，2004，23（29）：4975-4983.

［5］ Chen X Q，Wang SJ，Du JZ.Diversities in hepatic HIF-1，IGF-I／IGFBP-1，LDH／ICD，and theirmRNA expressions induced by CoCl2in Qinghai-Tibetan plateau mammals and sea levelmice［J］.Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol，2007，292（1）：R516-526.