馬福家 司曉莉 曾曉娟

（中國人民解放軍第四五五醫(yī)院藥劑科 上海 200052）

護肝膠囊由藥典收載品種護肝片改造工藝而來，制劑處方由柴胡、五味子等組成，具有疏肝理氣，健脾消食，降低轉(zhuǎn)氨酶的作用，用于慢性肝炎、遷延性肝炎及早期肝硬化等[1]。五味子，俗稱山花椒、秤砣子、藥五味子、面藤、五梅子等，《新修本草》載“五味皮肉甘酸，核中辛苦，都有咸味”，故有五味子之名。《中國藥典》2010版采用高效液相色譜法測定五味子甲素的含量來控制五味子的質(zhì)量，中成藥中五味子甲素的含量測定方法已有報道[2-3]，但對護肝膠囊中五味子甲素的含量測定鮮有報道?，F(xiàn)對制劑中五味子甲素含量進行測定以控制護肝膠囊的質(zhì)量。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

UFLC-20AD超快速液相色譜儀、PAD檢測器MB20A、LCsolution色譜工作站（日本島津公司）；BP211D型1/10萬電子天平（德國Sartorius公司）；電熱恒溫水浴鍋(南通通海電器廠)。

1.2 試藥

五味子甲素對照品（購自中國藥品生物制品檢定所）；水為娃哈哈純凈水；實驗中所用化學試劑除高效液相用甲醇、乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純；護肝膠囊由吉林修正藥業(yè)集團股份有限公司提供，陰性對照為本實驗室自制。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件及系統(tǒng)適應性

色 譜 柱：Agilent SB C18(100 mm×4.6 mm，1.8 μm)；流動相： 水為流動相A，乙腈為流動相B；梯度洗脫：0～3 min(B ：55%)，3～15 min(B ：55%～20%)，15～15.1 min(B：20%～0)，15.1～17 min( B：0)；流速：0.4 ml/min；柱溫：40 ℃ ；檢測波長 ：250 nm ；進樣量 2 μl。

2.2 對照品溶液的制備

取五味子甲素對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 ml含五味子甲素48.9 μg的對照品溶液， 經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過，即得。

2.3 供試品溶液的制備

取護肝膠囊內(nèi)容物適量，混勻，研細，取約0.7 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入水飽和的乙酸乙酯25 ml，密塞，稱定重量，超聲處理30 min，放冷，搖勻，濾過，精密量取續(xù)濾液15 ml，蒸干，殘渣用甲醇溶解，轉(zhuǎn)移至5 ml容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過后，即得。

2.4 陰性對照溶液的制備

按處方組成比例制備缺五味子陰性制劑，再按供試品溶液的制備方法，制備五味子陰性對照溶液。

2.5 系統(tǒng)適用性實驗

吸取五味子甲素對照品溶液、護肝膠囊供試品溶液及缺五味子的陰性對照品溶液各10 μl，注入超高速液相色譜儀進行分析，結(jié)果表明，陰性對照溶液在與五味子甲素對照品峰相同的保留時間處無干擾峰出現(xiàn)，說明處方中其他味藥對測定結(jié)果無影響，結(jié)果見圖1。

2.6 線性關(guān)系考察

精密吸取2.2項下的對照品溶液1、5、10、15、20μl，注入超高速液相色譜儀，記錄峰面積。以進樣量X（μg）為橫坐標，峰面積積分值Y為縱坐標，繪制標準曲線，五味子甲素的回歸方程為：Y=37 960X+93 183（r=0.999 8），表明五味子甲素進樣量分別在0.016～0.323 μg/μl范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系。

2.7 精密度試驗

取2.2項下的對照品溶液，按上述色譜條件，重復進樣5次，進樣量5 μl，測定峰面積值，計算五味子甲素峰面積的RSD=0.80(n=5)。結(jié)果表明精密度良好。

2.8 穩(wěn)定性試驗

取本品(批號110901)10 ml，按2.3項下供試品制備方法制備供試品溶液，按上述色譜條件，分別于0、4、8、12、24 h進樣1次，考察精密度(RSD=0.60，n=5)，結(jié)果供試品溶液中五味子甲素在24 h內(nèi)峰面積無明顯變化。

圖1 護肝膠囊及對照品UFLC圖

2.9 重復性試驗

取護肝膠囊樣品(批號：110901)5份，按2.3項下方法制備樣品供試液，按上述色譜條件進行含量測定，結(jié)果五味子甲素平均含量為0.373 827 mg/g，RSD為3.20(n=5)， 表明此法重復性良好。

2.10 回收率試驗

取同一批已知含量的樣品(批號110901) 5份，每份5 ml，分別準確加入對照品溶液五味子甲素（16.3 μg/ml）8 ml。按2.3項下供試品溶液制備方法制備供試品溶液，按其項下色譜條件進行測定，計算回收率。五味子甲素平均回收率(n=5)為96.5%，RSD為2.5。試驗結(jié)果表明加樣回收率良好。

2.11 樣品測定

取3批護肝膠囊(批號分別為091103、110802、081101)，照上述方法測定護肝膠囊中五味子甲素的含量，結(jié)果見表1。

表1 三批護肝膠囊樣品的含量測定結(jié)果（mg/g）

3 討論

護肝膠囊中五味子具有氣陰雙補，養(yǎng)肝護肝之效。其中五味子甲素為主要有效成分，因此測定護肝膠囊中五味子甲素的主要含量，對更好地控制護肝膠囊的內(nèi)在質(zhì)量具有重要意義。

在流動相的選擇上，我們曾采用藥典中的流動相即甲醇-水(63：37）。但分離效果不是很好，故選用了乙睛-水為流動相進行梯度洗脫的方法，五味子甲素與其它雜質(zhì)峰分離良好。

在儀器使用上，本文所采用的超快速液相色譜。超快速液相色譜(ultra fast liquid chromatography，UFLC)是近年來出現(xiàn)的新技術(shù)，其色譜柱選用1.8 μm粒度的C18填料，因此可獲得更高的柱效，并在更寬的線速度范圍內(nèi)能保持柱效恒定，有利于提高流動相流速、節(jié)省分析時間和增加峰容量。與HPLC相比，UFLC具有超高分離度、超高速度和超高靈敏度的優(yōu)點，因而適于成分復雜的中藥等樣品的分離。

[1]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典(一部)[M].北京:中國醫(yī)藥科技出版社,2010: 760-761.

[2]沙美,史道芬,歐陽強.高效液相色譜法測定護肝膠囊中五味子醇甲的含量[J].時珍國醫(yī)國藥,2007,18(7): 1671-1672．

[3]杜英峰,袁志芳,王春英,等.高效液相色譜法同時測定護肝片中五味子甲素和五味子乙素的含量[J].藥物分析,2004,24(4): 397-399.